本文關(guān)鍵詞：宮頸癌SPINT2基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究

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【摘要】：持續(xù)高危型人乳頭瘤病毒的感染已被廣泛認為是導致宮頸癌的主要病因,HPV感染后會引起遺傳學及表觀遺傳學的改變,DNA甲基化是宮頸癌發(fā)生過程中重要的表觀遺傳學機制。目的:探討宮頸癌細胞系及宮頸癌組織中SPINT2基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)及其對表達的影響,并分析SPINT2基因甲基化與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系。方法:選取HPV陽性宮頸癌細胞系HeLa、CaSki、SiHa,HPV陰性宮頸癌細胞系HT-3、C-33A及50例宮頸癌組織、20例正常宮頸組織作為研究對象。采用5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)處理HeLa細胞系,載有HPV16 E6/E7基因的慢病毒感染HT-3細胞系,并用甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)以及亞硫酸氫鹽基因組測序法(Bisulfite genomic sequencing,BGS)檢測宮頸癌細胞系、宮頸組織、5-Aza-CdR處理后的HeLa細胞及慢病毒感染后的HT-3細胞SPINT2基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài),實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR)檢測其轉(zhuǎn)錄表達情況。結(jié)果:①細胞系甲基化狀態(tài):MSP結(jié)果顯示HPV陽性宮頸癌細胞系HeLa細胞系只出現(xiàn)M條帶,CaSki、SiHa細胞系出現(xiàn)M+U條帶,HPV陰性宮頸癌細胞系HT-3、C-33A細胞系只出現(xiàn)U條帶,5-Aza-CdR處理后的HeLa細胞出現(xiàn)M+U條帶,慢病毒感染后的HT-3細胞仍為U條帶。BGS結(jié)果顯示HeLa細胞系甲基化率為95.1%,CaSki細胞系甲基化率為46.3%,SiHa細胞系甲基化率為32.1%,C-33A細胞系甲基化率為4.9%,而HT-3細胞系中未見甲基化位點,5-Aza-CdR處理后的HeLa細胞甲基化率降為56.0%,慢病毒感染后的HT-3細胞甲基化率為8.8%。②宮頸組織甲基化狀態(tài):50例宮頸癌組織中SPINT2基因呈現(xiàn)出3種不同的甲基化狀態(tài),其中M型有2例(2/50,4%),M+U型25例(25/50,50%),U型23例(23/50,46%)。而20例正常宮頸組織中僅有5例出現(xiàn)M+U型(5/20,25%),余15例均為U型(15/20,75%)。宮頸癌組織甲基化率高于正常宮頸組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.028)。其中HPV陽性宮頸癌組織46例,其甲基化狀態(tài)為:M型有2例(2/46,4.35%),M+U型25例(25/46,54.35%),U型19例(23/46,50%);4例HPV陰性宮頸癌組織均為U型。HPV陽性宮頸癌組織甲基化率高于HPV陰性宮頸癌組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.038)。③SPINT2基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化率與宮頸癌的分級有相關(guān)性(P=0.003),其中G3的甲基化率高于G2,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.001),G1與G2、G1與G3之間的差異無統(tǒng)計學意義。而SPINT2的甲基化與年齡、分期、病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、陰道累及情況均無明顯相關(guān)性(P0.05)。④三種HPV陽性細胞系中SPINT2 mRNA轉(zhuǎn)錄表達量較兩種HPV陰性細胞系表達量低,表達差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.027)。5-Aza-CdR處理前后HeLa細胞中SPINT2基因的轉(zhuǎn)錄表達存在顯著性差異,處理后為處理前的3.945倍,載有HPV16 E6/E7基因的慢病毒感染HT-3細胞后,SPINT2基因的轉(zhuǎn)錄表達量為感染前的0.688倍。⑤宮頸癌組織中mRNA的轉(zhuǎn)錄表達量低于正常宮頸組織,表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.032)。⑥發(fā)生甲基化的宮頸組織mRNA的轉(zhuǎn)錄表達量低于未發(fā)生甲基化的宮頸組織,表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。結(jié)論:①SPINT2基因啟動子及第1外顯子區(qū)的甲基化率在宮頸癌中明顯高于正常宮頸組織。②HPV陽性宮頸癌細胞系甲基化率高于HPV陰性宮頸癌細胞系,HPV陽性宮頸癌組織甲基化率高于HPV陰性宮頸癌組織,表明SPINT2基因甲基化狀態(tài)可能與HPV的感染有關(guān)。③宮頸癌中SPINT2基因啟動子及第1外顯子區(qū)發(fā)生甲基化與其mRNA轉(zhuǎn)錄表達下調(diào)密切相關(guān)。④SPINT2基因的甲基化狀態(tài)與宮頸癌的分級有相關(guān)性,在低分化的宮頸癌組織中甲基化率高于中分化組織。
【關(guān)鍵詞】：SPINT2 宮頸癌 人乳頭瘤病毒 甲基化 5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-7
• 引言7-9
• 第一章 材料與方法9-21
• 1.1 主要儀器、試劑和耗材9-11
• 1.2 宮頸癌細胞系及宮頸組織標本的選擇與處理11-12
• 1.3 細胞系總蛋白的提取12
• 1.4 RNA的提取與處理12-13
• 1.5 DNA 提取和焦亞硫酸鹽處理13-15
• 1.6 驗證慢病毒感染成功15-18
• 1.7 SPINT2 甲基化狀態(tài)的檢測18-19
• 1.8 Real-time q PCR分析SPINT2 基因m RNA的轉(zhuǎn)錄表達19-20
• 1.9 統(tǒng)計方法20-21
• 第二章 結(jié)果21-31
• 2.1 穩(wěn)定感染細胞獲得及目的基因表達鑒定21-22
• 2.2 SPINT2 基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測結(jié)果22-27
• 2.3 Real-time q PCR檢測SPINT2 基因的轉(zhuǎn)錄表達情況27-31
• 第三章 討論31-34
• 第四章 結(jié)論34-35
• 參考文獻35-39
• 綜述39-49
• 綜述參考文獻45-49
• 攻讀學位期間研究成果49-50
• 致謝50-51

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本文編號：856337