本文關(guān)鍵詞：EGF-PAMAM靶向遞送MDR1-siRNA逆轉(zhuǎn)子宮肉瘤細(xì)胞多藥耐藥的研究

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【摘要】：背景子宮肉瘤(Uterine sarcomas, US)是繼宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌之后的女性生殖系統(tǒng)第四大惡性腫瘤,隨著診斷技術(shù)的不斷改進(jìn)和發(fā)展,其發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。子宮肉瘤生長(zhǎng)迅速、侵襲性強(qiáng)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移早,難于治療且容易復(fù)發(fā)及耐藥。多年來(lái),對(duì)其治療方案的探索一直是研究的重點(diǎn)。手術(shù)是子宮肉瘤首要的治療方法,而輔助放化療對(duì)殘余腫瘤細(xì)胞的殺傷性也不容忽視。盆腔及宮腔內(nèi)放療可以顯著降低子宮肉瘤的局部復(fù)發(fā)率。Wataru Yamagami等在對(duì)常規(guī)化療藥物(阿霉素、異環(huán)磷酰胺和順鉑)治療子宮肉瘤療效的回顧性分析指出,不同化療藥物單用或聯(lián)用反應(yīng)率和疾病控制率不一致,聯(lián)合用藥能顯著延長(zhǎng)患者生存期。遺憾的是,越來(lái)越多的證據(jù)表明,化療藥物的廣泛應(yīng)用加速了子宮肉瘤多藥耐藥現(xiàn)象(Multidrug resistance, MDR)的出現(xiàn)。細(xì)胞對(duì)某種藥物產(chǎn)生耐藥的同時(shí),對(duì)其他分子結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制完全不同的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象稱之為多藥耐藥。研究表明,多藥耐藥產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜,而目前研究最為廣泛的耐藥機(jī)制由MDR1基因編碼P-糖蛋白(P-glyprotein, P-gp)過(guò)度表達(dá)所介導(dǎo)。P-gp是一種分子量較高的細(xì)胞表面糖蛋白,屬于ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員之一,具有能量依賴性藥物外排的作用,在ATP供能的前提下,可將化療藥物泵出細(xì)胞外,從而降低胞內(nèi)化療藥物蓄積量。RNA干擾技術(shù)是美國(guó)科學(xué)家安德魯·法爾(Andrew Z Fire)和克雷格·梅洛(Craig Mello)發(fā)現(xiàn)的能夠精確沉默轉(zhuǎn)錄后靶基因表達(dá)的熱門(mén)研究工具,21-25 bp的小干擾RNA (small interfering RNA,siRNA)是整個(gè)RNA干擾過(guò)程中起核心作用的分子,具有級(jí)聯(lián)放大的靶基因沉默效應(yīng),非常適用于阻滯腫瘤細(xì)胞或組織中異�；蛲蛔兊鞍椎谋磉_(dá)。目前,siRNA靶向沉默MDR1基因逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的研究已在頭頸鱗癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌等腫瘤的治療中得到了證實(shí)。然而,裸露的siRNA難以被細(xì)胞攝取導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下,其次易被體內(nèi)外核酸酶降解導(dǎo)致半衰期短、穩(wěn)定性差。因此,安全高效的遞送載體有助于siRNA順利進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮治療作用。siRNA藥物遞送載體系統(tǒng)研究主要分為病毒載體以及非病毒載體,從國(guó)際上已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段并具有一定成藥性的基因治療藥物來(lái)看,新型非病毒載體材料已成為主流(如陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物)。目前生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究及應(yīng)用最為廣泛的一類陽(yáng)離子聚合物聚酰-酰胺(Polyamide-amine,PAMAM),以乙二胺為核,采用發(fā)散法通過(guò)迭代的Michael加成和酰胺化反應(yīng)所合成。近年來(lái),PAMAM因其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和表面特性(納米級(jí)尺寸、內(nèi)部大空腔、單分散性、多價(jià)性、可以量身定制的高密度表面功能基團(tuán)等)在遞送DNA、 siRNA、寡核苷酸等基因物質(zhì)方面所表現(xiàn)出來(lái)的潛能吸引了越來(lái)越多科研人員的注意。在生理?xiàng)l件下表面攜帶有正電荷的PAMAM分子,通過(guò)靜電吸引力與表面帶有負(fù)電荷的siRNA分子相結(jié)合,將siRNA分子包裹在內(nèi)使之免受核酸酶降解并通過(guò)內(nèi)吞作用促進(jìn)細(xì)胞攝取,有利于siRNA分子順利參與RNA干擾過(guò)程,實(shí)現(xiàn)靶基因沉默的目的。目前,PAMAM遞送siRNA至細(xì)胞內(nèi)用于靶向沉默前列腺癌熱休克蛋白表達(dá)、抑制艾滋病毒復(fù)制等取得較好療效。研究表明,某些受體在腫瘤細(xì)胞表面特異性表達(dá)或過(guò)度表達(dá),因此,利用受體與對(duì)應(yīng)配體的特異性結(jié)合,可將藥物分子選擇性遞送至受體過(guò)度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中,謂之為受體介導(dǎo)的腫瘤靶向給藥系統(tǒng),此法可以顯著提高藥物輸送的有效性和靶向性。PAMAM分子高密度表面功能基團(tuán)為肽、生物素等的修飾提供了豐富的作用位點(diǎn),進(jìn)而利用受體-配體結(jié)合的特異性提高PAMAM分子遞送的靶向性。目前研究較為廣泛的靶點(diǎn)主要包括EGFR、 Her2分子等。已有研究證實(shí),通過(guò)對(duì)PAMAM表面功能基團(tuán)進(jìn)行活性多肽EGF修飾,可將siRNA分子特異性遞送至細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞中,這為受體介導(dǎo)的PAMAM分子靶向遞送核酸類物質(zhì)提供了廣闊的應(yīng)用前景。但在子宮肉瘤細(xì)胞中,是否可以通過(guò)EGF-PAMAM遞送系統(tǒng)將靶向MDR1基因的siRNA遞送至細(xì)胞中,探討其特異性沉默MDR1基因及其下游分子表達(dá),進(jìn)而聯(lián)合臨床化療藥物發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞凋亡等生物學(xué)作用,這些都有待于進(jìn)一步證實(shí)。因此,本課題擬以子宮肉瘤耐藥細(xì)胞(MES-SA/DX5)為研究對(duì)象,設(shè)計(jì)靶向EGFR的PAMAM-siRNA遞送系統(tǒng),利用自組裝技術(shù)構(gòu)建高效低毒EGF-PAMAM-MDR1-siRNA復(fù)合物,通過(guò)RNAi技術(shù)下調(diào)MDR1基因的表達(dá)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥現(xiàn)象,同時(shí)聯(lián)合臨床經(jīng)典化療藥物紫杉醇,觀察siRNA類基因物質(zhì)聯(lián)合化療藥物對(duì)子宮肉瘤耐藥細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響。目的1、通過(guò)分子自組裝技術(shù)構(gòu)建高效靶向基因復(fù)合物EGF-PAMAM-MDR1-siRNA;2、考察EGF-PAMAM-MDR1-siRNA基因復(fù)合物在MES-SA/DX5中的入胞情況；3、考察MDR1基因的體外沉默效應(yīng)(mRNA和蛋白水平)；4、聯(lián)合臨床經(jīng)典化療藥物紫杉醇,考察基因物質(zhì)聯(lián)合化療藥物對(duì)MES-SA/DX5細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響。方法1、基因復(fù)合物的制備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果,基因復(fù)合物PAMAM表面胺基與siRNA表面磷酸基團(tuán)的最佳比例(N/P)為20：1,siRNA:EGF修飾物質(zhì)量比=2：1。將EGF、 PAMAM、 siRNA分別與相應(yīng)體積的Opti-MEM混勻,分別制成對(duì)應(yīng)的A、B、C液。制成PAMAM-MDR1-siRNA二元基因復(fù)合物,則將B液緩慢加入C液中,輕輕混勻,室溫靜置20 min。制成EGF-PAMAM-MDR1-siRNA三元基因復(fù)合物,則將A液緩慢加入B液與C液的混合物中,室溫靜置20 min。2、基因復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染及其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響：MES-SA/DX5細(xì)胞鋪板至相應(yīng)培養(yǎng)板,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。棄舊培養(yǎng)基,1×PBS與Opti-MEM培養(yǎng)基各清洗一次細(xì)胞,將據(jù)1所述方法制備的基因復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)板,6h后換完全培養(yǎng)基,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18h或42 h。于轉(zhuǎn)染后0 h、6 h、24 h、48 h后,將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。3、激光共聚焦顯微鏡(Confocal)考察基因復(fù)合物的入胞：所用siRNA經(jīng)Cy5標(biāo)記。經(jīng)基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育18 h后,棄舊培養(yǎng)基,加入Honechest 33342染液1 mL/孔,孵育10 min后于Zeiss LSM 710倒置激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察Cy5-siRNA進(jìn)入MES-SA/DX5細(xì)胞情況。4、 RT-PCR、 Western Blot、流式細(xì)胞術(shù)和Confocal考察基因復(fù)合物對(duì)MES-SA/DX5細(xì)胞中MDR1基因的沉默效應(yīng)：所用siRNA為MDRl-siRNA。經(jīng)基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育42 h后收集所有的細(xì)胞,或提取所有細(xì)胞的RNA或蛋白。所提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA繼而進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),經(jīng)核酸電泳后分析MDR1基因mRNA表達(dá)情況。所提取的蛋白經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育及顯色后分析P-gp蛋白表達(dá)情況。所收集的細(xì)胞直接加入FITC標(biāo)記的鼠抗人P-gp IgG,4℃暗處孵育30 min后立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-gp蛋白的平均熒光強(qiáng)度。經(jīng)基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育42 h后棄舊培養(yǎng)基,加阿霉素溶液(ADM) 500 μL/孔(10μg/mL)繼續(xù)孵育4h后棄ADM加Honechest 33342染液500μL/孔孵育10 min,經(jīng)Zeiss LSM 710倒置金屬激光掃描共聚焦顯微鏡觀察MES-SA/DX5細(xì)胞對(duì)ADM的攝取情況,側(cè)面驗(yàn)證MDR1基因的沉默效應(yīng)。5、 Western Blot檢測(cè)基因復(fù)合物與Taxol聯(lián)用對(duì)MES-SA/DX5細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2,Caspase-3)表達(dá)的影響：經(jīng)基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染6h后的MES-SA/DX5細(xì)胞,聯(lián)合應(yīng)用Taxol溶液孵育48 h后提取所有細(xì)胞的蛋白。所提取的蛋白經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育及顯色后分析Bcl-2, Caspase-3蛋白表達(dá)情況。6、CCK-8檢測(cè)不同濃度基因復(fù)合物與Taxol聯(lián)用對(duì)MES-SA/DX5細(xì)胞增殖毒性的影響：所用siRNA濃度分別為2,5,10 μg/mL所用Taxol濃度分別為5,10 μg/mL經(jīng)不同濃度基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染6h后的MES-SA/DX5細(xì)胞,聯(lián)合應(yīng)用Taxol溶液孵育24 h、48 h后,加入CCK-8 10 μL/孔繼續(xù)孵育4h后經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)MES-SA/DX5細(xì)胞吸光度值,根據(jù)公式分析MES-SA/DX5細(xì)胞增殖毒性情況。7、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)基因復(fù)合物與Taxol聯(lián)用對(duì)MES-SA/DX5細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響：經(jīng)基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染6h后的MES-SA/DX5細(xì)胞,聯(lián)合應(yīng)用Taxol溶液孵育24 h、48 h后收集所有細(xì)胞,經(jīng)洗滌、染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況和細(xì)胞凋亡情況。8、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因復(fù)合物與Taxol聯(lián)用對(duì)MES-SA/DX5細(xì)胞遷移能力的影響：先制備細(xì)胞劃痕模型,經(jīng)基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染6h后的細(xì)胞劃痕模型,聯(lián)合應(yīng)用Taxol溶液后孵育24 h。于轉(zhuǎn)染后采用Olympus (1X73)倒置顯微鏡拍照,分別采集轉(zhuǎn)染后Oh,6h,12 h,18 h,24 h這5個(gè)時(shí)間段細(xì)胞圖像,經(jīng)Olympus cellSens Dimension軟件分析MES-SA/DX5細(xì)胞遷移變化情況。結(jié)果1、經(jīng)分子自組裝技術(shù)構(gòu)建的EGF-PAMAM-MDR1-siRNA復(fù)合物基本不影響MES-SA/DX5細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),能顯著提高siRNA分子的細(xì)胞攝取率；2、通過(guò)EGF-PAMAM遞送的siRNA,能有效沉默MES-SA/DX5細(xì)胞MDR1基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)；3、 EGF-PAMAM-MDR1-siRNA復(fù)合物聯(lián)合經(jīng)典化療藥物Taxol作用后,可顯著抑制MES-SA/DX5細(xì)胞的增殖、遷移,使MES-SA/DX5細(xì)胞更多阻滯于S期,顯著提高細(xì)胞凋亡比例。結(jié)論綜上所述, PAMAM作為一種新型的非病毒載體材料,能夠有效將siRNA分子遞送至子宮肉瘤細(xì)胞,進(jìn)而沉默MES-SA/DX5細(xì)胞中MDR1基因mRNA和蛋白水平的表達(dá),經(jīng)EGF修飾后,沉默效應(yīng)更為顯著,聯(lián)用化療藥物Taxol后,細(xì)胞凋亡比例可顯著提高。MDR1基因在子宮肉瘤的多藥耐藥中起著至關(guān)重要的作用,有望成為治療耐藥性子宮肉瘤的有效靶點(diǎn),而通過(guò)EGF-PAMAM遞送靶向MDR1基因的siRNA可能是逆轉(zhuǎn)子宮肉瘤多藥耐藥的有效途徑。
【關(guān)鍵詞】：子宮肉瘤耐藥細(xì)胞 多藥耐藥基因1 小干擾RNA分子 表皮生長(zhǎng)因子 聚酰-酰胺樹(shù)狀大分子
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 第一章 前言19-30
• 第二章 EGF-PAMAM基因復(fù)合物靶向運(yùn)輸MDR1-siRNA對(duì)耐藥基因表達(dá)的影響30-57
• 1 材料與方法31-35
• 2 實(shí)驗(yàn)方法35-46
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-54
• 4 討論54-57
• 第三章 EGF-PAMAM基因復(fù)合物靶向運(yùn)輸MDR1-siRNA對(duì)細(xì)胞相關(guān)功能的影響57-79
• 1 材料與方法57-59
• 2 實(shí)驗(yàn)方法59-64
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果64-76
• 4 討論76-79
• 全文總結(jié)79-80
• 本課題局限性與進(jìn)一步研究方向80-81
• 參考文獻(xiàn)81-86
• 縮略語(yǔ)中英文對(duì)照86-87
• 攻讀學(xué)位期間成果87-88
• 致謝88-89

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10 葉W毱，

本文編號(hào)：697157