本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導的利用siRNA干擾人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在宮頸癌Caski細胞中的研究

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【摘要】：第一章hTERT基因慢病毒表達載體的構(gòu)建與鑒定[摘要]目的：構(gòu)建及鑒定攜帶沉默人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)慢病毒表達載體,為進一步研究hTERT基因在宮頸癌中的作用機制奠定基礎(chǔ)。方法：以Designer3.0 ( Genepharma)軟件設(shè)計靶向hTERT基因特異性的小片段RNA (shRNA)干擾序列,將hTERT-shRNA基因片段插入重組慢病毒pGLV3/Hl/GFP+Puro,構(gòu)建慢病毒表達質(zhì)LV3-shRNA-hTERT,酶切、DNA測序驗證hTERT片段準確性。LV3-shRNA-hTERT與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,濃縮上清液并測定病毒滴度獲得重組慢病毒后感染caski細胞。將細胞分為空白對照組(未感染病毒的caski細胞)、陰性對照組(感染空載病毒LV3-shNC的caski細胞)和hTERT干擾組(感染攜帶LV3-shhTERT慢病毒的caski細胞)。綠色熒光蛋白(GFP)的表達判斷轉(zhuǎn)染結(jié)果并估計轉(zhuǎn)染效率,流式細胞術(shù)儀檢測病毒感染率,實時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染后基因hTERT mRNA的表達量。結(jié)果：將目的序列成功連接到載體上,并經(jīng)測序分析證實載體構(gòu)建成功；成功包裝成高滴度的慢病毒,且能有效感染子宮頸癌caski細胞。熒光定量PCR檢測結(jié)果證實構(gòu)建的hTERT-小片段干擾RNA慢病毒表達載體感染caski細胞后hTERT基因的表達量顯著低于空白組和對照組(P0.01)。結(jié)論：成功構(gòu)建了慢病毒表達載體LV3-siRNA-hTERT,能夠有效感染宮頸癌caski細胞,并使hTERTmRNA的表達量明顯降低,為進一步探討hTERT基因在子宮頸癌的發(fā)病機制和體外基因干預治療奠定基礎(chǔ)。第二章hTERT基因?qū)m頸癌caski細胞生物學影響的體外研究[摘要]目的：探索宮頸癌caski細胞中hTERT基因表達下調(diào)之后對其生物學功能的影響。方法：CCK-8法檢測三組細胞(NC、NC-LV、sihTERT-LV)的生長增殖情況,細胞平板克隆實驗檢測三組細胞的單克隆能力,采用流式細胞儀檢測三組細胞周期及細胞凋亡情況。結(jié)果：si-hTERT-LV組細胞生長速度、單細胞克隆能力明顯低于NC組及NC-LV組,差異有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。si-hTERT-LV組G1期細胞比率明顯高于NC組和NC-LV組,差異有統(tǒng)計學意義(P均0.05); si-hTERT-LV組S期細胞比率明顯低于NC組和NC-LV組,差異有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。si-hTERT-LV細胞凋亡率明顯高于NC-LV組和NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。結(jié)論：宮頸癌caski細胞沉默了hTERT基因后,明顯抑制細胞的生長,將細胞周期阻滯于GO/G1期,同時抑制其單克隆形成能力,增加細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：宮頸腫瘤 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因 慢病毒載體 小片段RNA caski細胞 宮頸癌 caski細胞 人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 細胞增殖 細胞凋亡 細胞周期
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 個人簡歷3-7
• 英文縮略詞7-9
• 摘要9-12
• ABSTRACT12-16
• 第一章 hTERT基因的慢病毒表達載體的構(gòu)建及鑒定16-63
• 1. 前言16-17
• 2. 材料與方法17-48
• 2.1 材料17-23
• 2.1.1 實驗對象17-18
• 2.1.2 主要實驗試劑18-19
• 2.1.3 主要溶液配制19-21
• 2.1.4 主要實驗儀器21-23
• 2.1.5 器具處理23
• 2.2 方法23-48
• 2.2.1 表達hTERT-shRNA的慢病毒載體構(gòu)建23-33
• 2.2.2 慢病毒包裝、濃縮、收集33-40
• 2.2.3 用構(gòu)建好的病毒轉(zhuǎn)染靶細胞40-42
• 2.2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的建立42-43
• 2.2.5 實驗分組43-44
• 2.2.6 實時熒光定量PCR反應(yīng)檢測hTERT mRNA水平的表達44-48
• 2.3 統(tǒng)計學方法48
• 3. 結(jié)果與分析48-55
• 3.1 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果48-50
• 3.2 慢病毒滴度的測定50-51
• 3.3 干擾序列的抗性篩選及流式細胞儀檢測感染效率51-52
• 3.4 總RNA完整性純度檢測52-53
• 3.5 實時熒光定量PCR檢測hTERT基因的變化53-55
• 4. 討論55-58
• 參考文獻58-63
• 第二章 慢病毒介導的利用siRNA沉默hTERT基因?qū)m頸癌caski細胞生物學功能的影響63-90
• 1. 前言63-64
• 2. 材料與方法64-77
• 2.1 實驗對象、實驗試劑、實驗儀器64-68
• 2.1.1 實驗對象64
• 2.1.2 主要實驗試劑64-65
• 2.1.3 主要試劑的配置65-67
• 2.1.4 實驗儀器67-68
• 2.1.5 實驗器具處理68
• 2.2 方法68-77
• 2.2.1 細胞株的培養(yǎng)68-69
• 2.2.2 細胞平板克隆形成實驗69-71
• 2.2.3 細胞增殖的CCK-8檢測71-73
• 2.2.4 細胞生長周期的檢測73-76
• 2.2.5 細胞凋亡的檢測76-77
• 2.3 統(tǒng)計學分析77
• 3. 結(jié)果與分析77-84
• 3.1 CCK-8法測定細胞生長曲線77-79
• 3.2 細胞平板克隆實驗結(jié)果79-80
• 3.3 流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果80-82
• 3.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果82-84
• 4. 討論84-86
• 參考文獻86-90
• 綜述90-102
• 參考文獻96-102
• 全文小結(jié)102
• 研究創(chuàng)新性總結(jié)102-103
• 攻讀學位期間發(fā)表學術(shù)論文103-104
• 致謝104-106
• 附件106-111

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號：689661