本文關(guān)鍵詞：DAZL和BOULE基因促進(jìn)小鼠早期生殖分化的研究

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【摘要】：據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道,全球適齡里面有大約15%正在遭受不育不孕癥的困擾[1],而我國(guó)的調(diào)查報(bào)告顯示,約有10%的已婚夫婦患有不孕不育癥,也就是說(shuō)平均每6對(duì)夫婦中就有一對(duì)沒(méi)有辦法有自己的孩子。更為嚴(yán)重的是,近年來(lái)的數(shù)據(jù)顯示,不育不孕癥的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。不孕不育癥的原因非常多,生殖細(xì)胞形成異常是其主要的原因之一。目前,臨床上對(duì)于不育不孕癥的治療主要采取輔助生殖的手段解決,但是對(duì)于某些精子發(fā)生障礙的患者,輔助生殖仍然沒(méi)有辦法幫助他們得到健康的子代[1,2]。但是,體細(xì)胞重編程(Somatic reprogramming)以及多能性干細(xì)胞(Pluripotency stem cells)向生殖細(xì)胞分化的技術(shù)對(duì)解決這個(gè)問(wèn)題而言是一個(gè)有效的解決方法[1,3]。原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells, PGCs)是最早期的生殖細(xì)胞,能反映一種細(xì)胞的特征[4,5]。原始生殖細(xì)胞具有單能性,能夠分化到精子和卵細(xì)胞[4,6]。除此之外,原始生殖細(xì)胞在合適的培養(yǎng)環(huán)境中還能重新獲得類似于胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells)的多能性[7-11]。哺乳動(dòng)物原始生殖細(xì)胞特化是在胚胎發(fā)育過(guò)程中響應(yīng)特定的信號(hào)通路[12-23]下進(jìn)行的。在胚胎7.25天,胚外外胚層組織分泌BMP信號(hào)通路相關(guān)的因子作用于外胚層細(xì)胞,進(jìn)而這些細(xì)胞獲得發(fā)育到原始生殖細(xì)胞的命運(yùn)。原始生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中,包括兩個(gè)主要的事件：一個(gè)是表觀的改變,包括全基因組的去甲基化和甲基化[24-34],印記的擦除和重新建立[35-37]；另一個(gè)是多能性的重新獲得。因此,對(duì)于原始生殖細(xì)胞既是研究體外生殖分化的重要對(duì)象,又是對(duì)表觀遺傳學(xué)等學(xué)科進(jìn)行基礎(chǔ)研究的重要對(duì)象。目前對(duì)于原始生殖細(xì)胞的研究國(guó)際和國(guó)內(nèi)已經(jīng)取得了卓越的成績(jī)。目前,日本科學(xué)家Mitinori Saitou率領(lǐng)的小組建立了Blimp1-mVenus (BV)和Stella-ECFP(SC)雙標(biāo)記的細(xì)胞系,能夠靈敏的指示原始生殖細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程[1,3,38]；并且通過(guò)Bmp4和Bmp8a的誘導(dǎo)得到原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞,進(jìn)一步分化分化可以得到單倍體精子細(xì)胞,通過(guò)單精子卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)注射可以得到健康的后代；在此基礎(chǔ)上,通過(guò)過(guò)表達(dá)Blimp1,Prdm14, Tcfap2c三個(gè)生殖特化過(guò)程中所必須的基因可以獲得PGCLCs。然而,PGCLCs的數(shù)量缺乏仍然是在早期生殖分化進(jìn)行表觀遺傳學(xué)和生化分析的瓶頸之一,因此,如何高效的獲得PGCLCs仍然是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。DAZ (Deleted in Azoospermia)家族基因是在在生殖細(xì)胞中特異表達(dá)的基因家族[39,40],包括三個(gè)成員：DAZL, DAZ, BOULE.在小鼠基因組中,只存在位于常染色體上的DAZL和BOULE基因[39,41-43]。DAZ家族基因在蛋白結(jié)構(gòu)上有相同的機(jī)構(gòu),包括一個(gè)保守的RNA識(shí)別模塊(RNA recognition motif, RRM),以及由24個(gè)氨基酸殘基組成的DAZ模塊。DAZ家族基因主要作用mRNA的3'UTR區(qū)[39,44]。DAZL和BOULE的自然缺失和敲除實(shí)驗(yàn)證明,DAZL和BOULE是生殖細(xì)胞分化必須的基因[45-48]。我們通過(guò)在已有建立的整合有Blimp1, Prdm14和Tcfap2c三個(gè)過(guò)表達(dá)基因的含有Blimp1-m Venus和Stella-ECFP報(bào)告基因的胚胎干細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,建立了穩(wěn)定整合有DAZL和BOULE的小鼠胚胎干細(xì)胞系。體外早期生殖分化的研究顯示,過(guò)表達(dá)DAZL和BOULE能夠促進(jìn)PGCLC的分化,并且特異基因也有逐步高表達(dá)的趨勢(shì)。小鼠DAZ家族基因可能是通過(guò)激活PGCs早期特異基因的表達(dá)從而提高PGCLCs的分化效率。本工作揭示DAZL和BOULE基因在早期生殖細(xì)胞特化過(guò)程中具有一定的功能,為提高生殖細(xì)胞分化效率提供了線索。
【關(guān)鍵詞】：基因 BDULE基因 原始生殖細(xì)胞體外分化
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R711.6
【目錄】：

• 摘要5-7
• abstract7-9
• 綜述9-24
• 1. 原始生殖細(xì)胞9-19
• 1.1 原始生殖細(xì)胞的簡(jiǎn)介9-10
• 1.2 原始生殖細(xì)胞的命運(yùn)進(jìn)程10-12
• 1.3 原始生殖細(xì)胞的發(fā)育潛能12-14
• 1.4 原始生殖細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子14-16
• 1.5 原始生殖細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)16-17
• 1.6 原始生殖細(xì)胞的表觀重編程17-19
• 1.7 總結(jié)19
• 2 DAZL和BOULE基因在生殖系統(tǒng)的關(guān)鍵作用19-24
• 2.1 關(guān)于DAZ家族基因的基礎(chǔ)知識(shí)19-20
• 2.2 DAZL和BOULE基因在小鼠生殖系統(tǒng)中的研究進(jìn)展20-23
• 2.3 總結(jié)23-24
• 前言24-26
• 3 實(shí)驗(yàn)材料26-31
• 3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物26
• 3.2 主要儀器設(shè)備26
• 3.3 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材26-28
• 3.4 實(shí)驗(yàn)主要試劑與配制28-31
• 4 實(shí)驗(yàn)步驟與方法31-43
• 4.1 小鼠飼養(yǎng)層細(xì)胞的建立與培養(yǎng)31-32
• 4.1.1 CF1小鼠胎兒成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)31
• 4.1.2 CF1小鼠成纖維細(xì)胞制作飼養(yǎng)層細(xì)胞31-32
• 4.2 Blimp1-mVenus和Stella-ECFP轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立32-33
• 4.2.1 BVSC囊胚的獲得32
• 4.2.2 胚胎干細(xì)胞系的建立32
• 4.2.3 BVSC胚胎干細(xì)胞系的建立32-33
• 4.3 質(zhì)粒抽提33-34
• 4.3.1 菌液的獲取33-34
• 4.3.2 質(zhì)粒大提34
• 4.4 慢病毒的包裝34
• 4.4.1 293T細(xì)胞擴(kuò)增34
• 4.4.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染34
• 4.5 Blimp1、Prdm14、AP2γ過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的建立34-37
• 4.5.1 小鼠胚胎干細(xì)胞系的復(fù)蘇、擴(kuò)增35
• 4.5.2 病毒感染35
• 4.5.3 挑取亞克隆篩選建系35-37
• 4.6 過(guò)表達(dá)DAZL和BOULE小鼠ES細(xì)胞系的建立37-38
• 4.7 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄38-39
• 4.7.1 總RNA的提取38
• 4.7.2 反轉(zhuǎn)錄成cDNA38-39
• 4.8 Real-time PCR39-40
• 4.9 體外生殖分化40-41
• 4.9.1 胚胎干細(xì)胞向外胚層樣細(xì)胞的分化40-41
• 4.9.2 EpiLCs向PGCLCs的分化41
• 4.10 小鼠胚胎干細(xì)胞多能性蛋白免疫熒光染色41-42
• 4.11 基因組的提取42-43
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析43-50
• 1 Blimp1-mVenus和Stella-ECFP雙報(bào)告基因的小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立43
• 2 穩(wěn)定整合Blimp1、Prdml4和AP2γ的小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立43-45
• 3 DAZL和BOULE轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞系的建立45-46
• 4 DAZL和BOULE加速PGCLCs的分化進(jìn)程,提高PGCLCs的分化效率46-50
• 討論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-61
• 致謝61

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1 薛清彩;吳紹華;;人原始生殖細(xì)胞的研究現(xiàn)狀[J];四川解剖學(xué)雜志;2007年03期

2 冷少華;李彩霞;梁志清;王鳳英;;人原始生殖細(xì)胞的分離和培養(yǎng)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年08期

3 冷麗智;林戈;盧光t;;原始生殖細(xì)胞發(fā)生的機(jī)制[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年18期

4 喬江麗;趙恩鋒;彭紅梅;;人類原始生殖細(xì)胞的起源、遷移、增殖及凋亡過(guò)程[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2012年01期

5 李林鳳;白秀娟;張艷艷;關(guān)偉軍;;雞胚原始生殖細(xì)胞的建系方法及其影響因素[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2007年46期

6 華進(jìn)聯(lián);雷安民;徐小明;竇忠英;;原始生殖細(xì)胞的凋亡[J];中國(guó)臨床康復(fù);2006年13期

7 何素云;潘承彬;;人胎睪丸的組織發(fā)生[J];解剖學(xué)報(bào);1986年02期

8 唐奕,盧光t;人原始生殖細(xì)胞體外培養(yǎng)的初步研究[J];湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2003年05期

9 李臻,張遠(yuǎn)強(qiáng),王瑞安;原始生殖細(xì)胞遷移的分子機(jī)理[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;1999年02期

10 劉永剛,陳地龍,李芳菲,王莎莉,王亞平;人原始生殖細(xì)胞的遷移及表面標(biāo)志物變化的實(shí)驗(yàn)研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年08期

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1 葛楚天;于敏莉;曾衛(wèi)東;張才喬;;雌激素對(duì)雞胚原始生殖細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)理的研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

2 趙麗玲;羅榕;程瑾;原一桐;王文魁;李慧鋒;;雞生殖細(xì)胞原代培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家禽學(xué)分會(huì)第九次代表會(huì)議暨第十六次全國(guó)家禽學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2013年

3 葛秀國(guó);楊繼建;竇忠英;;小鼠原始生殖細(xì)胞的遷移(英文)[A];全國(guó)首屆動(dòng)物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

4 郭新;張艷敏;漆正宇;秦潔;崔光輝;桂耀庭;蔡志明;;小鼠iPS細(xì)胞具備誘導(dǎo)性原始生殖細(xì)胞分化潛能的研究[A];2011中國(guó)（威海）干細(xì)胞與組織工程治療前沿論壇論文集[C];2011年

5 武艷群;張才喬;;雞胚原始生殖細(xì)胞多能性基因表達(dá)的研究[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第十次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2008年

6 于敏莉;葛楚天;張才喬;;維甲酸對(duì)雞胚原始生殖細(xì)胞增殖的影響[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2010年

7 劉雨瀟;華進(jìn)聯(lián);竇忠英;;小鼠原始生殖細(xì)胞研究進(jìn)展[A];全國(guó)首屆動(dòng)物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

8 謝冰;芮榮;盧曉;劇世強(qiáng);黃國(guó)慶;楊倩;;小鼠原始生殖細(xì)胞在生殖嵴的定位[A];全國(guó)獸醫(yī)外科學(xué)第13次學(xué)術(shù)研討會(huì)、小動(dòng)物醫(yī)學(xué)第1次學(xué)術(shù)研討會(huì)暨奶牛疾病第3次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2006年

9 史小林;路欣;許晴;孟慶峰;上官芳芳;;培養(yǎng)小鼠原始生殖細(xì)胞飼養(yǎng)層體系的新方法-Sertoli細(xì)胞對(duì)小鼠原始生殖細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)作用的研究[A];解剖學(xué)雜志——中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2002年年會(huì)文摘匯編[C];2002年

10 唐新燕;葛楚天;張才喬;;雞胚原始生殖細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)模型的建立[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第九次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2006年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 新華;雄大馬哈魚生出虹鱒魚[N];中國(guó)漁業(yè)報(bào);2004年

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1 林帆;基于vasa/dnd基因標(biāo)記的兩種海水魚原始生殖細(xì)胞發(fā)生發(fā)育的研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 喬江麗;人類原始生殖細(xì)胞的鑒定[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2012年

2 王美芝;小鼠胚胎雌雄原始生殖細(xì)胞發(fā)育的比較研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

3 李明;鵪鶉原始生殖細(xì)胞系的建立及鑒定[D];福建農(nóng)林大學(xué);2008年

4 馮涵琪;RNA結(jié)合蛋白LIN28在男胎原始生殖細(xì)胞中的表達(dá)[D];鄭州大學(xué);2014年

5 丁紅梅;慢病毒轉(zhuǎn)染雞胚原始生殖細(xì)胞及性腺嵌合體雞的制備[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

6 解名名;DAZL和BOULE基因促進(jìn)小鼠早期生殖分化的研究[D];安徽大學(xué);2015年

7 馬婧;豬原始生殖細(xì)胞的生物學(xué)特性及bFGF對(duì)其克隆形成率的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

8 圖雅;蒙古綿羊原始生殖細(xì)胞用于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

9 熊浩;山羊原始生殖細(xì)胞的分離培養(yǎng)[D];揚(yáng)州大學(xué);2010年

10 游秀容;大黃魚原始生殖細(xì)胞發(fā)生、遷移及性腺性別分化的組織學(xué)研究[D];集美大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：592417