本文關(guān)鍵詞：A2M和CRABP2基因介導(dǎo)Fas凋亡信號通路逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥的研究

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【摘要】：目的本課題組前期成功利用卵巢癌SKOV3細胞株建立了卵巢癌的裸鼠順鉑耐藥模型, 得到了卵巢癌順鉑獲得性耐藥細胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ,并對其耐藥過程進行了動態(tài)系統(tǒng)生物學(xué)分析,整和基因表達譜及蛋白質(zhì)譜的數(shù)據(jù)信息后,篩選到α2巨球蛋白(A2M)和視黃酸結(jié)合蛋白Ⅱ (CRABP2)在各處理組的耐藥細胞中均顯著降低。本實驗繼續(xù)前期的研究,將A2M和CRABP2導(dǎo)入TCGA提供的499例卵巢癌人類組織全基因組表達譜數(shù)據(jù)中,分別分析它們與卵巢癌患者鉑類化療耐藥和臨床預(yù)后等的相關(guān)性,為將A2M和CRABP2作為潛在的卵巢癌鉑類耐藥途徑的上游調(diào)控分子提供臨床依據(jù)。另外,進一步在基因和蛋白水平上對A2M和CRABP2進行功能驗證,并探討它們表達失衡后對下游耐藥相關(guān)信號通路的影響,為尋找逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的新的靶點奠定基礎(chǔ)。方法利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析A2M和CRABP2基因的mRNA表達在敏感和耐藥患者中的差異；ROC曲線分析二者的表達是否與耐藥相關(guān)；采用Pearson相關(guān)分析二者的表達與卵巢癌患者的總生存期,化療間隔生存期和無進展生存期的關(guān)系；Cox regression分析A2M和CRABP2基因診斷卵巢癌患者耐藥的敏感性；最后將TCGA提供的283例卵巢癌患者全基組表達譜數(shù)據(jù)分別分為A2M和CRABP2高低表達兩個組,Kaplan-Meierw分別分析卵巢癌患者鉑類化療間隔生存期在A2M和CRABP2高低表達組之間的差異。利用課題組前期建立的卵巢癌順鉑獲得性耐藥的SKOV3-GFP/DDPⅡ細胞株和順鉑敏感的SKOV3-GFP親本細胞株分別在裸鼠皮下種植成瘤,成瘤后分次順鉑體內(nèi)干預(yù),實時熒光定量PCR和Western Blot驗證分次順鉑干預(yù)的移植瘤組織中A2M和CRABP2的mRNA和蛋白表達,檢測瘤組織中與細胞增殖及凋亡相關(guān)的主要通路中重要節(jié)點基因的表達水平,分析二者的表達變化對下游信號通路表達變化的影響。利用PWPI和pSico慢病毒表達系統(tǒng)和SKOV3-GFP/DDPⅡ細胞株,構(gòu)建CRABP2基因過表達的順鉑耐藥細胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2,并且采用mcherry紅色熒光標(biāo)記,CCK試劑盒分析過表達CRABP2后細胞的IC50、耐藥指數(shù)的變化,Western Blot檢測CRABP2基因過表達后對細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白表達和下游Fas細胞凋亡信號通路上節(jié)點基因的蛋白表達的影響。結(jié)果相對于敏感病例,A2M和CRABP2基因在鉑類耐藥患者表達下降(P0.05,P0.05),與耐藥相關(guān)(P0.05,P0.05),與卵巢癌患者總生存期,化療間隔生存期和無進展生存期高度相關(guān)(P0.00,P0.00),它們的表達量越高,患者的生存期越長；Cox regression分析結(jié)果也表明二者可以作為獨立的卵巢癌患者預(yù)后的指標(biāo)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)A2M和CRABP2的表達與卵巢癌患者的鉑類耐藥相關(guān)(Area=0.969,0.980) 。Kaplan-Meierw分析結(jié)果證實A2M和CRABP2高低表達組的患者的鉑類化療間隔生存時間均有顯著差異(P0.00)。細胞凋亡相關(guān)的Fas信號通路上重要節(jié)點基因Fas, FADD, Caspase10, Caspase9和Caspase3隨順鉑注射次數(shù)的增加在耐藥組織中相對低表達(P0.00),而其下游與DNA修復(fù)相關(guān)的基因PARP1隨順鉑注射次數(shù)的增加在耐藥的移植瘤組織中相對高表達(P0.05)。所有這些基因在移植瘤組織中的蛋白表達也呈現(xiàn)與mRNA大致一致的趨勢。不同次數(shù)順鉑作用后的瘤組織中A2M、CRABP2的mRNA相對表達量與Fas信號通路節(jié)點基因和下游PARP1的表達變化均存在相關(guān)性(P0.05,P0.00)。相對于SKOV3-GFP/DDPⅡ和空白對照的SKOV3-GFP/DDPⅡ-Blank細胞株,過表達CRABP2的SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2細胞株對于順鉑的IC50均顯著降低(P0.00),耐藥指數(shù)明顯下降(P0.00)；其細胞周期被顯著抑制,細胞凋亡被激活：細胞周期依賴性蛋白激酶CDK4、CDK6和CDK2以及細胞周期蛋白cyclin D1的表達在SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2細胞中顯著減弱(P0.00),而細胞周期的阻斷劑p27 kip1的蛋白表達顯著增強(P0.00);Fas凋亡信號通路上的節(jié)點基因Fas、FADD、Caspase10、 Caspase9和Caspase3的蛋白表達顯著增強(P0.00),而凋亡信號通路下游的DNA修復(fù)相關(guān)基因PARP1的蛋白表達則顯著降低(P0.05),即過表達CRABP2基因后的卵巢癌順鉑耐藥細胞恢復(fù)了對順鉑的敏感性。結(jié)論A2M和CRABP2與卵巢癌的順鉑耐藥有關(guān),它們在耐藥的卵巢癌細胞和組織中表達減弱。二者作為潛在鉑類耐藥調(diào)控信號途徑的上游關(guān)鍵信號分子,可通過激活Fas凋亡信號通路的作用維持卵巢癌細胞對鉑類藥物的敏感性,過表達后可使耐藥的卵巢癌細胞恢復(fù)對順鉑的反應(yīng)性。這給臨床上逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥的治療提供了新的靶點和理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：卵巢上皮癌 鉑類耐藥 A2M CRABP2 Fas細胞凋亡信號傳導(dǎo)通路 TGCA
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 個人簡歷3-6
• 主要中英文縮略語對照6-10
• 摘要10-13
• ABSTRACT13-17
• 第一章 卵巢癌鉑類耐藥的研究進展(文獻綜述)17-48
• 1. 卵巢癌臨床化療的現(xiàn)狀17-27
• 2. 鉑類藥物的抗腫瘤機制27-31
• 3. 鉑類抗腫瘤藥物耐藥的機制31-46
• 4. 鉑類耐藥研究面臨的問題46
• 5. 本文研究的目的和意義46-48
• 第二章 A2M和CRABP2基因與卵巢癌臨床預(yù)后的關(guān)系分析以及二者在動物模型中的表達驗證48-84
• 前言48-49
• 1 數(shù)據(jù)材料與數(shù)據(jù)分析方法49
• 1.1 TCGA數(shù)據(jù)來源49
• 1.2 數(shù)據(jù)分析方法49
• 2 實驗材料與實驗方法49-68
• 2.1 細胞和動物來源50
• 2.2 主要試劑和儀器50-54
• 2.3 細胞培養(yǎng)54-57
• 2.4 裸鼠皮下移植瘤的建立57-58
• 2.5 裸鼠皮下移植瘤RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄為cDNA58-61
• 2.6 實時熒光定量PCR(QRT-PCR)61-62
• 2.7 Western Blot驗證蛋白表達62-68
• 2.8 實驗數(shù)據(jù)的計算68
• 2.9 統(tǒng)計分析方法68
• 3 結(jié)果68-78
• 3.1 A2M和CRABP2基因與卵巢癌臨床預(yù)后的關(guān)系分析68-71
• 3.2 A2M與CRABP2基因在裸鼠移植瘤中的表達驗證71-78
• 4 討論78-84
• 第三章 A2M和CRABP2基因調(diào)控Fas凋亡信號通路的研究84-105
• 前言84-85
• 1 材料與方法85-87
• 1.1 細胞和動物來源85
• 1.2 主要試劑和儀器85-86
• 1.3 引物的設(shè)計及合成86-87
• 1.4 實時熒光定量PCR(QRT-PCR)87
• 1.5 Western Blot驗證蛋白表達87
• 1.6 A2M、CRABP2的mRNA相對表達與Fas信號通路節(jié)點基因以及下游基因的相關(guān)性分析87
• 1.7 實驗數(shù)據(jù)的計算與統(tǒng)計分析方法87
• 2 實驗結(jié)果87-99
• 2.1 QRT-PCR檢測Fas凋亡信號通路上節(jié)點基因mRNA的相對表達87-93
• 2.2 Western Blot檢測Fas凋亡信號通路節(jié)點基因在分次順鉑干預(yù)后的裸鼠移植瘤組織中的蛋白表達93-98
• 2.3 A2M、CRABP2的表達與Fas信號通路節(jié)點基因以及下游基因的相關(guān)性分析98-99
• 3 討論99-105
• 第四章 A2M和CRABP2基因逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞鉑類耐藥的功能研究105-143
• 前言105-106
• 1 材料與方法106-116
• 1.1 實驗材料106-107
• 1.2 實驗方法107-116
• 2 結(jié)果116-137
• 2.1 建立穩(wěn)定過表達CRABP2基因的SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2細胞株116-118
• 2.2 CCK試劑盒檢測細胞對順鉑的IC50和耐藥指數(shù)的計算118-119
• 2.3 Western Blot檢測過表達CRABP2基因后的耐藥細胞中細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白和Fas凋亡信號通路上節(jié)點蛋白的表達變化119-136
• 2.4 A2M蛋白對SKOV3-GFP/DDPⅡ細胞耐藥性的影響136-137
• 3 討論137-143
• 第五章 全文總結(jié)143-144
• 參考文獻144-168
• 致謝168-170
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文170

【參考文獻】

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本文編號：561672