本文關(guān)鍵詞：A2M和CRABP2基因介導(dǎo)Fas凋亡信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥的研究

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【摘要】：目的本課題組前期成功利用卵巢癌SKOV3細(xì)胞株建立了卵巢癌的裸鼠順鉑耐藥模型, 得到了卵巢癌順鉑獲得性耐藥細(xì)胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ,并對(duì)其耐藥過(guò)程進(jìn)行了動(dòng)態(tài)系統(tǒng)生物學(xué)分析,整和基因表達(dá)譜及蛋白質(zhì)譜的數(shù)據(jù)信息后,篩選到α2巨球蛋白(A2M)和視黃酸結(jié)合蛋白Ⅱ (CRABP2)在各處理組的耐藥細(xì)胞中均顯著降低。本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)前期的研究,將A2M和CRABP2導(dǎo)入TCGA提供的499例卵巢癌人類組織全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)中,分別分析它們與卵巢癌患者鉑類化療耐藥和臨床預(yù)后等的相關(guān)性,為將A2M和CRABP2作為潛在的卵巢癌鉑類耐藥途徑的上游調(diào)控分子提供臨床依據(jù)。另外,進(jìn)一步在基因和蛋白水平上對(duì)A2M和CRABP2進(jìn)行功能驗(yàn)證,并探討它們表達(dá)失衡后對(duì)下游耐藥相關(guān)信號(hào)通路的影響,為尋找逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的新的靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。方法利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析A2M和CRABP2基因的mRNA表達(dá)在敏感和耐藥患者中的差異；ROC曲線分析二者的表達(dá)是否與耐藥相關(guān)；采用Pearson相關(guān)分析二者的表達(dá)與卵巢癌患者的總生存期,化療間隔生存期和無(wú)進(jìn)展生存期的關(guān)系；Cox regression分析A2M和CRABP2基因診斷卵巢癌患者耐藥的敏感性；最后將TCGA提供的283例卵巢癌患者全基組表達(dá)譜數(shù)據(jù)分別分為A2M和CRABP2高低表達(dá)兩個(gè)組,Kaplan-Meierw分別分析卵巢癌患者鉑類化療間隔生存期在A2M和CRABP2高低表達(dá)組之間的差異。利用課題組前期建立的卵巢癌順鉑獲得性耐藥的SKOV3-GFP/DDPⅡ細(xì)胞株和順鉑敏感的SKOV3-GFP親本細(xì)胞株分別在裸鼠皮下種植成瘤,成瘤后分次順鉑體內(nèi)干預(yù),實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot驗(yàn)證分次順鉑干預(yù)的移植瘤組織中A2M和CRABP2的mRNA和蛋白表達(dá),檢測(cè)瘤組織中與細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)的主要通路中重要節(jié)點(diǎn)基因的表達(dá)水平,分析二者的表達(dá)變化對(duì)下游信號(hào)通路表達(dá)變化的影響。利用PWPI和pSico慢病毒表達(dá)系統(tǒng)和SKOV3-GFP/DDPⅡ細(xì)胞株,構(gòu)建CRABP2基因過(guò)表達(dá)的順鉑耐藥細(xì)胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2,并且采用mcherry紅色熒光標(biāo)記,CCK試劑盒分析過(guò)表達(dá)CRABP2后細(xì)胞的IC50、耐藥指數(shù)的變化,Western Blot檢測(cè)CRABP2基因過(guò)表達(dá)后對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)和下游Fas細(xì)胞凋亡信號(hào)通路上節(jié)點(diǎn)基因的蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果相對(duì)于敏感病例,A2M和CRABP2基因在鉑類耐藥患者表達(dá)下降(P0.05,P0.05),與耐藥相關(guān)(P0.05,P0.05),與卵巢癌患者總生存期,化療間隔生存期和無(wú)進(jìn)展生存期高度相關(guān)(P0.00,P0.00),它們的表達(dá)量越高,患者的生存期越長(zhǎng)；Cox regression分析結(jié)果也表明二者可以作為獨(dú)立的卵巢癌患者預(yù)后的指標(biāo)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)A2M和CRABP2的表達(dá)與卵巢癌患者的鉑類耐藥相關(guān)(Area=0.969,0.980) 。Kaplan-Meierw分析結(jié)果證實(shí)A2M和CRABP2高低表達(dá)組的患者的鉑類化療間隔生存時(shí)間均有顯著差異(P0.00)。細(xì)胞凋亡相關(guān)的Fas信號(hào)通路上重要節(jié)點(diǎn)基因Fas, FADD, Caspase10, Caspase9和Caspase3隨順鉑注射次數(shù)的增加在耐藥組織中相對(duì)低表達(dá)(P0.00),而其下游與DNA修復(fù)相關(guān)的基因PARP1隨順鉑注射次數(shù)的增加在耐藥的移植瘤組織中相對(duì)高表達(dá)(P0.05)。所有這些基因在移植瘤組織中的蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)與mRNA大致一致的趨勢(shì)。不同次數(shù)順鉑作用后的瘤組織中A2M、CRABP2的mRNA相對(duì)表達(dá)量與Fas信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)基因和下游PARP1的表達(dá)變化均存在相關(guān)性(P0.05,P0.00)。相對(duì)于SKOV3-GFP/DDPⅡ和空白對(duì)照的SKOV3-GFP/DDPⅡ-Blank細(xì)胞株,過(guò)表達(dá)CRABP2的SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2細(xì)胞株對(duì)于順鉑的IC50均顯著降低(P0.00),耐藥指數(shù)明顯下降(P0.00)；其細(xì)胞周期被顯著抑制,細(xì)胞凋亡被激活：細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶CDK4、CDK6和CDK2以及細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的表達(dá)在SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2細(xì)胞中顯著減弱(P0.00),而細(xì)胞周期的阻斷劑p27 kip1的蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P0.00);Fas凋亡信號(hào)通路上的節(jié)點(diǎn)基因Fas、FADD、Caspase10、 Caspase9和Caspase3的蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P0.00),而凋亡信號(hào)通路下游的DNA修復(fù)相關(guān)基因PARP1的蛋白表達(dá)則顯著降低(P0.05),即過(guò)表達(dá)CRABP2基因后的卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞恢復(fù)了對(duì)順鉑的敏感性。結(jié)論A2M和CRABP2與卵巢癌的順鉑耐藥有關(guān),它們?cè)谀退幍穆殉舶┘?xì)胞和組織中表達(dá)減弱。二者作為潛在鉑類耐藥調(diào)控信號(hào)途徑的上游關(guān)鍵信號(hào)分子,可通過(guò)激活Fas凋亡信號(hào)通路的作用維持卵巢癌細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的敏感性,過(guò)表達(dá)后可使耐藥的卵巢癌細(xì)胞恢復(fù)對(duì)順鉑的反應(yīng)性。這給臨床上逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥的治療提供了新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：卵巢上皮癌 鉑類耐藥 A2M CRABP2 Fas細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路 TGCA
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.31
【目錄】：

• 個(gè)人簡(jiǎn)歷3-6
• 主要中英文縮略語(yǔ)對(duì)照6-10
• 摘要10-13
• ABSTRACT13-17
• 第一章 卵巢癌鉑類耐藥的研究進(jìn)展(文獻(xiàn)綜述)17-48
• 1. 卵巢癌臨床化療的現(xiàn)狀17-27
• 2. 鉑類藥物的抗腫瘤機(jī)制27-31
• 3. 鉑類抗腫瘤藥物耐藥的機(jī)制31-46
• 4. 鉑類耐藥研究面臨的問(wèn)題46
• 5. 本文研究的目的和意義46-48
• 第二章 A2M和CRABP2基因與卵巢癌臨床預(yù)后的關(guān)系分析以及二者在動(dòng)物模型中的表達(dá)驗(yàn)證48-84
• 前言48-49
• 1 數(shù)據(jù)材料與數(shù)據(jù)分析方法49
• 1.1 TCGA數(shù)據(jù)來(lái)源49
• 1.2 數(shù)據(jù)分析方法49
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法49-68
• 2.1 細(xì)胞和動(dòng)物來(lái)源50
• 2.2 主要試劑和儀器50-54
• 2.3 細(xì)胞培養(yǎng)54-57
• 2.4 裸鼠皮下移植瘤的建立57-58
• 2.5 裸鼠皮下移植瘤RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄為cDNA58-61
• 2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT-PCR)61-62
• 2.7 Western Blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)62-68
• 2.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)算68
• 2.9 統(tǒng)計(jì)分析方法68
• 3 結(jié)果68-78
• 3.1 A2M和CRABP2基因與卵巢癌臨床預(yù)后的關(guān)系分析68-71
• 3.2 A2M與CRABP2基因在裸鼠移植瘤中的表達(dá)驗(yàn)證71-78
• 4 討論78-84
• 第三章 A2M和CRABP2基因調(diào)控Fas凋亡信號(hào)通路的研究84-105
• 前言84-85
• 1 材料與方法85-87
• 1.1 細(xì)胞和動(dòng)物來(lái)源85
• 1.2 主要試劑和儀器85-86
• 1.3 引物的設(shè)計(jì)及合成86-87
• 1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT-PCR)87
• 1.5 Western Blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)87
• 1.6 A2M、CRABP2的mRNA相對(duì)表達(dá)與Fas信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)基因以及下游基因的相關(guān)性分析87
• 1.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析方法87
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果87-99
• 2.1 QRT-PCR檢測(cè)Fas凋亡信號(hào)通路上節(jié)點(diǎn)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)87-93
• 2.2 Western Blot檢測(cè)Fas凋亡信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)基因在分次順鉑干預(yù)后的裸鼠移植瘤組織中的蛋白表達(dá)93-98
• 2.3 A2M、CRABP2的表達(dá)與Fas信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)基因以及下游基因的相關(guān)性分析98-99
• 3 討論99-105
• 第四章 A2M和CRABP2基因逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞鉑類耐藥的功能研究105-143
• 前言105-106
• 1 材料與方法106-116
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料106-107
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法107-116
• 2 結(jié)果116-137
• 2.1 建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CRABP2基因的SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2細(xì)胞株116-118
• 2.2 CCK試劑盒檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50和耐藥指數(shù)的計(jì)算118-119
• 2.3 Western Blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)CRABP2基因后的耐藥細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白和Fas凋亡信號(hào)通路上節(jié)點(diǎn)蛋白的表達(dá)變化119-136
• 2.4 A2M蛋白對(duì)SKOV3-GFP/DDPⅡ細(xì)胞耐藥性的影響136-137
• 3 討論137-143
• 第五章 全文總結(jié)143-144
• 參考文獻(xiàn)144-168
• 致謝168-170
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文170

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：561672