本文關(guān)鍵詞：下調(diào)RbAp48表達(dá)對人宮頸癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的抑制作用及其機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分下調(diào)RbAp48表達(dá)對人宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用目的：盡管對腫瘤的治療已取得了很大的進(jìn)步,但據(jù)美國癌癥協(xié)會2015年報告,全球范圍內(nèi)宮頸癌并未得到有效的控制,仍位列女性惡性腫瘤中發(fā)病和致死的第四位,嚴(yán)重威脅著女性的健康；尋找治療宮頸癌的新方法已成為當(dāng)務(wù)之急。近年研究發(fā)現(xiàn)Rb相關(guān)蛋白48 (Retinoblastoma Associated Protein 48, RbAp48,又稱RBBP4)在肺癌、肝癌及白血病細(xì)胞中呈現(xiàn)異常過表達(dá),顯示與腫瘤具有密切的相關(guān)性。本研究擬探索RbAp48在人宮頸癌的表達(dá)情況,進(jìn)一步研究下調(diào)RbAp48表達(dá)對人宮頸癌細(xì)胞增殖的影響。方法：1.組織芯片法檢測224例人宮頸癌及癌旁組織中RbAp48的表達(dá)；2.以siRNA干擾技術(shù)下調(diào)RbAp48的表達(dá)；3.Western blot法檢測siRbAp48下調(diào)人宮頸癌細(xì)胞RbAp48的表達(dá)水平；4.MTT、平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)RbAp48后對人宮頸癌細(xì)胞株Hela、MS751、 SiHa增殖的的影響；5.p-半乳糖苷酶染色檢測siRbAp48對Hela、MS751、SiHa細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)作用；6.流式細(xì)胞術(shù)檢測siRbAp48對細(xì)胞周期和凋亡的作用；7.以荷瘤小鼠模型觀察下調(diào)RbAp48表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響。結(jié)果：1. RbAp48在人宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織,宮頸癌組織中呈強(qiáng)陽性者占67.86%(152例),而癌旁組織呈強(qiáng)陽性者為19.15%(9例)(**P0.01)。2siRbAp48可有效下調(diào)Hela、MS751、SiHa細(xì)胞中RbAp48的表達(dá)。3Hela細(xì)胞在20nM siRbAp48作用下產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖的效果,50nM作用達(dá)峰值；效果最明顯為轉(zhuǎn)染后第4天,其生存率降至36.11±4.47%。4.MS751細(xì)胞在lOnM siRbAp48作用下產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖的效果,50nM作用達(dá)峰值,效果最明顯為轉(zhuǎn)染后第7天,其生存率降至47.80±5.08%。5.SiHa細(xì)胞在30nMsiRbAp48作用下產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖的效果,50nM作用達(dá)峰值；效果最明顯為轉(zhuǎn)染后第5天,其生存率為79.35±8.50%。6.細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Hela細(xì)胞siRNA NC對照組和siRbAp48組克隆形成數(shù)分別是87.17±8.63和36.67±2.89(**p0.01)；MS751細(xì)胞siRNA NC對照組和siRbAp48組克隆形成數(shù)分別是130±8.89和87.33±1.16(**p0.01); SiHa細(xì)胞siRNA NC對照組和siRbAp48組克隆形成數(shù)分別是36.67±2.31和31.67±2.09(p0.05)。7.Hela細(xì)胞在siRbAp48作用48小時后,G2/M期細(xì)胞比例上升為32.33±7.14%(**P0.01),顯示細(xì)胞發(fā)生了G2/M期阻滯；MS75 1細(xì)胞在siRbAp48作用96小時后G2/M期細(xì)胞比例上升為35.61±3.79%(**P0.01),顯示同樣發(fā)生了明顯的G2/M期阻滯。8.下調(diào)RbAp48后Hela、MS751細(xì)胞胞內(nèi)顆粒增多,p.半乳糖苷酶染色出現(xiàn)藍(lán)染,呈明顯的衰老表征。9Hela細(xì)胞在siRbAp48作用72小時出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象,其凋亡率為54.65±9.06%(**P0.01)； MS751細(xì)胞在siRbAp48作用 120小時出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象, 其凋亡率為32.20±4.47%(*P0.05)。10.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明下調(diào)RbAp48明顯抑制體內(nèi)腫瘤的生長。Hela細(xì)胞siRNA NC對照組的腫瘤體積為654.30±191.90mmm3,瘤重353.83±84.11mg; siRbAp48組體積為158.23±75.82 mml3(**P0.01)；瘤重107.92±68.51 mg (**P0.01)。MS751細(xì)胞siRNA NC對照組腫瘤的體積為182.20±76.09 mm3,瘤重163.78±76.86 mg; siRbAp48組瘤體體積為14.85±18.60mm3(**P0.01)；瘤重20.28±22.59 mg(**P0.01)。11. siRbAp48與順鉑聯(lián)用24h后,順鉑對Hela細(xì)胞的半數(shù)致死量從2.5μg/ml降至1.25μg/ml。結(jié)論：1RbAp48在人宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織細(xì)胞。2. siRbAp48能有效下調(diào)人宮頸癌細(xì)胞中RbAp48的表達(dá)。3.下調(diào)RbAp48表達(dá)可至Hela、MS751細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老和凋亡,抑制細(xì)胞的增殖。4.下調(diào)RbAp48能增加人宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。第二部分下調(diào)RbAp48表達(dá)抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究目的：我們先前應(yīng)用二代測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)RbAp48可抑制人肺癌A549細(xì)胞株Cyclin蛋白家族的表達(dá),并由此引起細(xì)胞周期的阻滯,我們推斷下調(diào)RbAp48對人宮頸癌細(xì)胞增殖抑制作用可能也與Cyclin蛋白通路有關(guān),我們就此進(jìn)行了相關(guān)研究,以探明下調(diào)RbAp48表達(dá)抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。方法：1Western blot法檢測下調(diào)RbAp48表達(dá)對人宮頸癌細(xì)胞Cyclin蛋白表達(dá)的影響；2.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)驗(yàn)證Cyclin蛋白家族在下調(diào)RbAp48抑制宮頸癌細(xì)胞生長中的作用；3. Western blot法檢測Cyclin作用下游蛋白CDK2、 CDK4、CDK6、Rb、E2F1等的表達(dá)；4.以聯(lián)合共轉(zhuǎn)染的方法觀察相關(guān)蛋白在siRbAp48抑制宮頸癌細(xì)胞生長中的作用；5.MTT法檢測細(xì)胞體外增殖能力。結(jié)果：1siRbAp48下調(diào)RbAp48表達(dá)后,Hela、MS751細(xì)胞的Cyclin D1、CyclinEl及Cyclin H的表達(dá)均明顯下調(diào)；相應(yīng)的CDK2、CDK4、CDK6蛋白也明顯下調(diào)。2.下調(diào)RbAp48表達(dá)后Hela、MS751細(xì)胞的磷酸化Rb (P-Rb)和E2F1明顯降低。3.與Hela、MS751細(xì)胞不同,SiHa細(xì)胞在下調(diào)RbAp48表達(dá)后,盡管Cyclin E1、CDK2、CDK4、CDK6、P-Rb、E2F1表達(dá)也均發(fā)生下調(diào),但Cyclin D1、Cyclin H的表達(dá)并未發(fā)生明顯的變化。4.以siRb下調(diào)Rb表達(dá)后顯著拮抗siRbAp48對細(xì)胞增殖的抑制作用；在Hela細(xì)胞,生存率由34.94±2.71%提高到56.12±2.72%(**P0.01)；在MS751細(xì)胞,生存率由44.24±5.83%提高到86.04±9.28%(**P0.01)；在SiHa細(xì)胞,生存率由80.03±7.65%提高到92.36±4.89%(**P0.01)。5.應(yīng)用siCyclin D1、siCyclin E1和siCyclin H能有效下調(diào)宮頸癌細(xì)胞中Cyclin D1、Cyclin E1和Cyclin H的表達(dá)；下調(diào)Cyclin D1和Cyclin H的表達(dá)后,能顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖,但下調(diào)Cyclin El表達(dá)后抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的效果則相對較弱。在Hela細(xì)胞中,siCyclin D1、 siCyclin H和siCyclin E1組的生存率分別為39.19±7.77%、40.10±4.02%和82.83±5.94%；在MS751細(xì)胞中,siCyclin D1、siCyclin H和siCyclin E1組的生存率分別為51.55±11.70%、49.61±7.51%和88.88±12.80%；在SiHa田胞中,siCyclin D1、siCyclin H和siCyclin E1組的生存率分別為64.34±4.45%、80.74±11.57%和88.25±8.43%。6.以siRb下調(diào)Rb表達(dá)后能拮抗siCyclin D1對細(xì)胞增殖的抑制作用。在Hela細(xì)胞,生存率由34.00±3.43%提高到46.54±2.96%(**P0.01)；在MS751細(xì)胞,生存率由50.41±4.17%提高到60.05±5.05%(**P0.01)；在SiHa田胞,生存率由66.05±6.56%提高到98.33±5.61%(**P0.01)。7.下調(diào)Rb表達(dá)后可拮抗siCyclin H對細(xì)胞增殖的抑制作用。在Hela細(xì)胞,生存率由43.68±4.13%提高到77.54±5.47%(**P0.01)；在MS751細(xì)胞,生存率由56.29±5.00%提高到86.84±6.95%(**P0.01)；在SiHa細(xì)胞,生存率由85.78±2.47%提高到97.54±3.57%(**P0.01)。結(jié)論：1.下調(diào)RbAp48表達(dá)顯著抑制宮頸癌細(xì)胞中CyclinD1、CyclinE、CyclinH的表達(dá)。2.下調(diào)CyclinD1或CyclinH后可產(chǎn)生與下調(diào)RbAp48相同的抑制細(xì)胞增殖的效果。3.siRb可拮抗siRbAp48、si Cyclin D1及Cyclin H抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的作用。4.下調(diào)Cyclin D1、Cyclin H表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯是siRbAp48巾制人宮頸癌細(xì)胞增殖的一個重要機(jī)制。5.下調(diào)Rb表達(dá)可降低siRbAp48抑制宮頸癌增殖的效果,表明siRbAP48對腫瘤的抑制作用部分是通過調(diào)節(jié)Rb-E2F通路實(shí)現(xiàn)的。第三部分下調(diào)RbAp48表達(dá)對人宮頸癌細(xì)胞株MS751遷移侵襲的抑制及其機(jī)制研究目的：腫瘤轉(zhuǎn)移是宮頸癌難以治愈的一個重要原因,抗遷移侵襲是根治宮頸癌的一個重要環(huán)節(jié),為此我們探討了下調(diào)RbAp48表達(dá)對人宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲的影響及其作用機(jī)制。方法：以劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室檢測下調(diào)RbAp48表達(dá)后對人宮頸癌細(xì)胞株MS751遷移侵襲的影響,以Western bolt檢測Vimentin、 N-cadherin、E-cadherin、Snail、Twist、MMP-2、TIMP-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果：1.劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào)RbAp48表達(dá)后MS751細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)均明顯減少(**P0.01)。2.siRbAp48作用后MS751的間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白Vimentin、N-cadherin、MMP-2表達(dá)明顯受到抑制；而上皮細(xì)胞表型蛋白E-cadherin、TIMP-2表達(dá)明顯升高, 表明MS751細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)樣變(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)受到了抑制。3.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)EMT上游調(diào)節(jié)蛋白Snail、Twist表達(dá)水平也發(fā)生了顯著下調(diào)。結(jié)論：下調(diào)RbAp48表達(dá)能有效抑制宮頸癌MS751細(xì)胞株的上皮.間充質(zhì)樣變,從而降低了細(xì)胞的遷移和侵襲能力；其作用機(jī)制與降低Snail、Twist的表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：RbAp48 宮頸癌 細(xì)胞 衰老 凋亡 順鉑 RbAp48 宮頸癌 Cyclin D1 Cyclin E1 Rb PRb E2F1 RbAp48 宮頸癌 遷移 侵襲 上皮-間充質(zhì)樣變
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第一部分 下調(diào)RbAp48表達(dá)對人宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制作用16-57
• 1.1 前言16-18
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料18-25
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法25-37
• 1.4 結(jié)果37-54
• 1.5 討論54-56
• 1.6 結(jié)論56-57
• 第二部分 下調(diào)RbAp48表達(dá)抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究57-75
• 2.1 前言57-58
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料58-59
• 2.3 試驗(yàn)方法59-61
• 2.4 結(jié)果61-72
• 2.5 討論72-73
• 2.6 結(jié)論73-75
• 第三部分 下調(diào)RbAp48表達(dá)對人宮頸癌細(xì)胞株MS751遷移侵襲的抑制作用及其機(jī)制研究75-87
• 3.1 前言75-76
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料76-77
• 3.3 試驗(yàn)方法77-78
• 3.4 結(jié)果78-84
• 3.5 討論84-86
• 3.6 結(jié)論86-87
• 參考文獻(xiàn)87-92
• 中英文縮寫詞對照表92-93
• 碩士期間發(fā)表論文93-94
• 致謝94-95

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本文編號：463234