本文關(guān)鍵詞：沉默二氫葉酸還原酶基因?qū)β殉舶┘?xì)胞體外生物學(xué)行為的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的:二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)在卵巢上皮癌鉑類耐藥細(xì)胞中高表達(dá)。該研究旨在探討DHFR基因沉默對卵巢癌細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響,為卵巢癌鉑類耐藥的治療奠定基礎(chǔ)。方法:設(shè)計DHFR基因靶向的發(fā)夾狀si RNA,篩選出最佳si RNA沉默片段,構(gòu)建攜帶有目的基因的慢病毒載體細(xì)胞即轉(zhuǎn)染組(DHFR-p GCSIL-SKOV3細(xì)胞)及陰性對照組細(xì)胞(p GCSIL-SKOV3細(xì)胞)。采用流式細(xì)胞儀檢測3組細(xì)胞在不同的順鉑質(zhì)量濃度(2.5、5.0、10.0和20.0μg/m L)下不同時間段(24、48及72 h)的凋亡情況以及IC_50順鉑質(zhì)量濃度(4.4μg/m L)的周期變化;采用高效液相色譜法檢測不同順鉑質(zhì)量濃度(2.5、5.0和7.5μg/m L)不同時間段(24和48 h)藥物作用后3組細(xì)胞內(nèi)的順鉑濃度。采用透射電鏡觀察IC_50順鉑質(zhì)量濃度(4.4μg/m L)3種細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果:將退火后的雙鏈寡核苷酸片段連接到p GCSIL/GFP載體,測序結(jié)果正確。轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后,蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)鑒定干擾效果。在給藥24、48和72 h后,DHFR-p GCSIL-SKOV3、p GCSIL-SKOV3及SKOV3三組細(xì)胞的凋亡率隨著順鉑質(zhì)量濃度(2.5、5.0、10.0和20.0μg/m L)的上升而升高,DHFR-p GCSIL-SKOV3細(xì)胞給藥48和72 h后的凋亡率明顯高于p GCSIL-SKOV3及SKOV3細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3組細(xì)胞在IC_50順鉑質(zhì)量濃度(4.4μg/m L)給藥24和48 h后,轉(zhuǎn)染組G_0/G_1期細(xì)胞比例較陰性及空白對照組明顯增多,G_2/M、S期則反之;而給藥72 h后,3組細(xì)胞以G_2/M及S期為主,轉(zhuǎn)染組低于陰性及空白對照組。采用高效液相法檢測細(xì)胞內(nèi)順鉑質(zhì)量濃度時,轉(zhuǎn)染組在2.5和5.0μg/m L順鉑質(zhì)量濃度給藥24和48 h后,其細(xì)胞內(nèi)順鉑濃度均明顯高于對照組。轉(zhuǎn)染組在7.5μg/m L順鉑質(zhì)量濃度給藥24 h后,其細(xì)胞內(nèi)順鉑濃度均明顯低于對照組細(xì)胞,在48 h后卻又高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.034,P=0.014)。未給藥時,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的微絲明顯多于對照組,線粒體亦改變明顯。IC_50(4.4μg/m L)給藥24和48 h后3組細(xì)胞均未見微絲;而給藥72 h后微絲明顯增多,且排列紊亂。結(jié)論:成功構(gòu)建攜帶DHFR基因的p GCSIL干擾慢病毒載體的卵巢癌細(xì)胞。通過對DHFR下調(diào)后耐藥性能研究得知,DHFR的下調(diào)與經(jīng)過鉑類藥物作用的體外卵巢癌細(xì)胞的藥物耐藥性有一定的聯(lián)系,卵巢癌細(xì)胞中下調(diào)DHFR基因可以考慮作為多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)機(jī)制。
【作者單位】： 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科;
【關(guān)鍵詞】： pGCSIL/GFP載體 二氫葉酸還原酶 高效液相色譜法 凋亡 透射電子顯微術(shù)
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項目(30960404) 廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃課題(桂科攻14124004) 廣西自然科學(xué)基金(2014jj AA40673)
【分類號】：R737.31
【正文快照】： 卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一,發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第3位,但其卻是婦科腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。由于卵巢癌發(fā)病隱匿,大部分患者確診時已為晚期(FIGO分期,Ⅲ期和Ⅳ期)[1]。目前卵巢癌的最佳治療方案是外科手術(shù)和以鉑類和紫杉醇為基礎(chǔ)的化療。但因

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本文編號：442041