本文關(guān)鍵詞：人類(lèi)早期胚胎植入前高通量測(cè)序遺傳學(xué)篩查的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本研究利用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(WGA)和高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)人類(lèi)早期胚胎植入前的遺傳學(xué)信息進(jìn)行篩查,從而為高通量測(cè)序技術(shù)在提高PGS/PGD技術(shù)的安全有效性方面奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。方法:選取于我院生殖中心行IVF/ICSI-ET并已生育健康嬰兒的患者,他們將凍存的剩余第三天優(yōu)質(zhì)胚胎41枚和囊胚9枚自愿捐獻(xiàn)用于科研并簽署知情同意書(shū)。D3胚胎和囊胚分別活檢單個(gè)卵裂球細(xì)胞和滋養(yǎng)外胚層5~10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(單細(xì)胞裂解、文庫(kù)制備、擴(kuò)增、檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度和完整性)�；顧z后D3胚胎進(jìn)一步培養(yǎng)觀察,若有囊胚形成則再行囊胚活檢和全基因組擴(kuò)增。全基因組擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測(cè)序,將待測(cè)片段與微球體連接和cDNA序列測(cè)定從而對(duì)植入前胚胎進(jìn)行染色體數(shù)目和16Mb以上缺失、重復(fù)的篩查。結(jié)果:1、活檢胚胎來(lái)源:41枚D3胚胎和9枚囊胚經(jīng)解凍復(fù)蘇后均存活。D3胚胎活檢后發(fā)育成囊胚的共5枚,共對(duì)55枚(D3胚胎41枚和囊胚14枚)胚胎進(jìn)行活檢和全基因組擴(kuò)增。2、全基因組擴(kuò)增結(jié)果:42枚胚胎擴(kuò)增成功(D3胚胎28枚和囊胚14枚),總擴(kuò)增成功率為76.4%(42/55)。D3胚胎中28枚擴(kuò)增成功,13枚擴(kuò)增失敗,D3胚胎單細(xì)胞的擴(kuò)增成功率68.3%(28/41)。14枚囊胚全部擴(kuò)增成功。對(duì)這42枚胚胎的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序分析。3、D3胚胎的高通量測(cè)序分析結(jié)果:28枚D3胚胎中11枚未檢測(cè)出染色體數(shù)目異常和16Mb以上缺失和重復(fù);2枚胚胎檢出染色體數(shù)目異常,5枚胚胎檢出片段16Mb的染色體缺失或重復(fù),10枚胚胎檢出染色體數(shù)目異常合并片段16Mb的缺失或重復(fù)。4、囊胚的高通量測(cè)序分析結(jié)果:14枚囊胚中8枚未檢測(cè)出染色體數(shù)目異常和16Mb以上缺失和重復(fù),5枚胚胎檢出染色體數(shù)目異常,1枚胚胎檢出片段16Mb的染色體缺失或重復(fù)。5、高通量測(cè)序技術(shù)染色體數(shù)目異常和16Mb的缺失、重復(fù)檢出率:本研究中總體染色體數(shù)目異常或者16Mb染色體片段的缺失、重復(fù)的檢出率為54.8%(23/42),D3胚胎和囊胚的檢出率分別為60.7%(17/28)和42.9%(6/14)。6、同一胚胎的D3和囊胚期的高通量測(cè)序分析結(jié)果:5枚胚胎分別在D3和D5(囊胚)做了單細(xì)胞活檢和滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢、全基因組擴(kuò)增和高通量測(cè)序,結(jié)果顯示同一胚胎的D3單細(xì)胞和囊胚滋養(yǎng)外胚層的染色體檢出信息是基本一致的。7、對(duì)捐獻(xiàn)胚胎的患者夫婦(共8對(duì))的臨床資料進(jìn)行回顧性分析發(fā)現(xiàn):這些夫婦均單獨(dú)存在或合并存在女方高齡(大于等于35歲)、嚴(yán)重男方因素,反復(fù)植入失敗和不良妊娠史,所有檢測(cè)的胚胎均來(lái)自存在這些高危因素的夫婦。涉及女方高齡、嚴(yán)重男方因素,反復(fù)植入失敗和不良妊娠史因素的胚胎染色體數(shù)目異�；�16Mb的缺失或重復(fù)異常檢出率分別為80%,33.33%,33.33%和28.57%。結(jié)論:1、人類(lèi)D3胚胎(7~9細(xì)胞)可以通過(guò)單卵裂球活檢、單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增和高通量測(cè)序進(jìn)行PGS/PGD,解決了囊胚形成率低無(wú)可活檢的胚胎用于PGS/PGD這一問(wèn)題,擴(kuò)展了高通量測(cè)序的適用范圍,更有利于高通量測(cè)序技術(shù)的臨床推廣和應(yīng)用。2、在體外受精—胚胎移植技術(shù)中,即使是優(yōu)質(zhì)胚胎,仍然存在一定比例的染色體數(shù)目異�；蛉旧w的缺失重復(fù),這可能是輔助生育技術(shù)中種植失敗或流產(chǎn)的重要原因。3、女方高齡、嚴(yán)重男方因素、反復(fù)植入失敗和具有不良妊娠史患者的胚胎具有較高的遺傳學(xué)異常的風(fēng)險(xiǎn),PGS技術(shù)可能有助于提高上述患者助孕治療的成功率和抱嬰率。4、分子生物學(xué)的飛速發(fā)展為PGS/PGD提供了更多的手段,胚胎的基因?qū)W信息會(huì)更精細(xì)和廣泛,但是基因的片段與功能、表型、疾病之間的關(guān)系研究將是一個(gè)長(zhǎng)期巨大的工作和課題。因此,PGS/PGD技術(shù)必須基于和患者的充分告知和知情同意,必須結(jié)合產(chǎn)前診斷和出生隨訪,才能保證這一技術(shù)安全有效的進(jìn)行,提高助孕治療的成功率和活產(chǎn)率。
【關(guān)鍵詞】：植入前遺傳學(xué)篩查 高通量測(cè)序 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增 染色體數(shù)目異常 缺失重復(fù) 體外受精 胚胎移植
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R714.8
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明10-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 1.研究對(duì)象15-17
• 2.研究方法17-21
• 2.1 單個(gè)卵裂球細(xì)胞的活檢17-18
• 2.2 囊胚期滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的活檢18-19
• 2.3 樣品包裝和運(yùn)輸19
• 2.4 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增（sigma試劑盒, DOP-PCR技術(shù)原理）19-20
• 2.4.1 單細(xì)胞裂解19
• 2.4.2 文庫(kù)制備19
• 2.4.3 擴(kuò)增19-20
• 2.4.4 擴(kuò)增產(chǎn)物濃度檢測(cè)20
• 2.4.5 擴(kuò)增產(chǎn)物完整性檢測(cè)20
• 2.5.高通量測(cè)序（high-throughput sequencing）20-21
• 2.5.1 待測(cè)片段與微球體連接20
• 2.5.2 cDNA序列測(cè)定20
• 2.5.3 結(jié)果判讀20-21
• 3.結(jié)果21-31
• 3.1 一般資料21
• 3.2 檢測(cè)結(jié)果21-22
• 3.2.1 全基因組擴(kuò)增結(jié)果21
• 3.2.2 高通量測(cè)序結(jié)果21-22
• 3.3.電泳膠圖22-27
• 3.4.核型分析圖27-30
• 3.5.胚胎的臨床資料回顧性分析30-31
• 4.討論31-46
• 4.1 染色體異常的發(fā)生機(jī)制和影響因素31-33
• 4.2 胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（Preimplantation genetic screening）33-35
• 4.3 全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification,WGA）35-37
• 4.3.1 引物延伸預(yù)擴(kuò)增（PEP）35
• 4.3.2 簡(jiǎn)并寡核苷酸引物-PCR（DOP-PCR）技術(shù)35-36
• 4.3.3 多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)36-37
• 4.3.4 多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（MALBAC）37
• 4.4 高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing）37-39
• 4.5.拷貝數(shù)變異（Copy-number variant，CNV）39-40
• 4.5.1CNV基本概述39
• 4.5.2 高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于CNV分析39-40
• 4.6 各種檢測(cè)技術(shù)的比較40-41
• 4.6.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction,PCR)40
• 4.6.2 熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization,FISH） 2940-41
• 4.6.3 比較基因組雜交技術(shù)（comparative genomic hybridization,CGH）和微陣列-比較基因組雜交技術(shù)（array-CGH）41
• 4.6.4 單核苷酸多態(tài)性-微陣列（SNP-array）41
• 4.6.5 高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing）41
• 4.7 存在的問(wèn)題41-44
• 4.7.1 全基因組擴(kuò)增中存在的問(wèn)題41-43
• 4.7.2 高通量測(cè)序技術(shù)中存在的問(wèn)題43
• 4.7.3 嵌合體43-44
• 4.8.高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于D3胚胎單細(xì)胞PGS44-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-54
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明54-55
• 綜述55-64
• 綜述參考文獻(xiàn)61-64
• 致謝64

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 史秋雯;丘映;許長(zhǎng)龍;黃茜;陳萍;;用11色探針檢測(cè)植入前胚胎非整倍體的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2013年07期

  本文關(guān)鍵詞：人類(lèi)早期胚胎植入前高通量測(cè)序遺傳學(xué)篩查的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：409319