本文關(guān)鍵詞：RNA干擾沉默HPV16 E6基因?qū)θ藢m頸癌SiHa細(xì)胞自噬的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:研究針對(duì)HPV16 E6基因的小干擾RNA是否能特異性抑制人宮頸癌SiHa細(xì)胞中HPV16 E6基因的表達(dá),進(jìn)一步從自噬體形態(tài)和自噬標(biāo)志物方面觀察沉默HPV16 E6基因?qū)θ藢m頸癌SiHa細(xì)胞中自噬的影響,以探討HPV病毒感染對(duì)細(xì)胞自噬的影響,為宮頸癌防治的發(fā)展提供新的思路。方法:1.構(gòu)建并鑒定真核表達(dá)載體sh138-HPV16 E6 siRNA。用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)SiHa細(xì)胞中,熒光顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察轉(zhuǎn)染情況;用EBSS處理SiHa細(xì)胞6h誘導(dǎo)自噬作為饑餓組(陽(yáng)性對(duì)照組);Real-time PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞中HPV16 E6 mRNA表達(dá)情況。2.透射電鏡觀察沉默HPV16 E6基因前后各組細(xì)胞中自噬體的形成。同時(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞中Beclin 1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1.重組質(zhì)粒sh138-HPV16 E6 siRNA的PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果和DNA測(cè)序圖譜分析均證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入宮頸癌SiHa細(xì)胞,約12h后在藍(lán)光激發(fā)的熒光顯微鏡下能夠察看到些許綠色熒光表達(dá),說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。約48h后熒光表達(dá)程度最強(qiáng),選擇10個(gè)200倍視野,計(jì)算發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)的比值,轉(zhuǎn)染效率約為(250±)%。轉(zhuǎn)染48h后實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明SiHa-sh138-HPV16 E6 siRNA組細(xì)胞中HPV16 E6mRNA表達(dá)量明顯下降,與SiHa組、饑餓組(陽(yáng)性對(duì)照組)、SiHa-sh138-NC組三者相比,結(jié)果具有顯著性差異(P0.001)。2.使用透射電鏡觀察細(xì)胞中自噬體的形態(tài)和數(shù)目,結(jié)果表明SiHa-sh138-HPV16 E6 siRNA組中自噬體的數(shù)量明顯少于SiHa組及SiHa-sh138-NC組(P0.05),饑餓組(陽(yáng)性對(duì)照組)自噬體數(shù)量明顯多于SiHa組及SiHa-sh138-NC組(P0.05)。3.使用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)人宮頸癌SiHa細(xì)胞中Beclin 1蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果表明SiHa-sh138-HPV16 E6組中Beclin 1蛋白表達(dá)水平明顯少于SiHa組及SiHa-sh138-NC組(P0.05),饑餓組(陽(yáng)性對(duì)照組)Beclin 1蛋白表達(dá)水平明顯高于SiHa組及SiHa-sh138-NC組(P0.05)。結(jié)論:1.沉默HPV16 E6基因表達(dá)的sh138-HPV16 E6 siRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能有效地沉默宮頸癌SiHa細(xì)胞中HPV16 E6基因的表達(dá)。2.HPV16 E6基因的沉默可明顯減少SiHa細(xì)胞中自噬體的形成,同時(shí)明顯下調(diào)細(xì)胞中Beclin 1蛋白的表達(dá)水平。
【關(guān)鍵詞】：宮頸癌 小干擾RNA 自噬 HPV16 E6基因
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 常用縮寫(xiě)詞中英文對(duì)照表10-11
• 前言11-14
• 第一部分 重組質(zhì)粒sh138-HPV16 E6 siRNA的構(gòu)建及鑒定14-33
• 1.材料與方法14-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料14-16
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法16-26
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法26-27
• 2.結(jié)果27-32
• 3.討論32-33
• 第二部分 沉默HPV16 E6基因?qū)iHa細(xì)胞中自噬的影響33-46
• 1.材料與方法33-38
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料33-34
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法34-37
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法37-38
• 2.結(jié)果38-43
• 3.討論43-45
• 4.結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 綜述49-58
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 致謝58-59
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果59-60
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷60

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  本文關(guān)鍵詞：RNA干擾沉默HPV16 E6基因?qū)θ藢m頸癌SiHa細(xì)胞自噬的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：405755