目的利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立YAF2(YY1 associated factor 2)基因敲除的宮頸癌He La細(xì)胞株,用于YAF2基因在宮頸癌細(xì)胞中分子功能的研究。方法首先利用CRISPR/Cas9序列設(shè)計(jì)網(wǎng)站,設(shè)計(jì)兩對(duì)靶向YAF2基因第2外顯子不同位點(diǎn)的向?qū)NA(single-guide RNA,sgRNA)�；瘜W(xué)合成sgRNA寡核苷酸序列,分別克隆至質(zhì)粒p X335中,測(cè)序確認(rèn)插入片段正確的克隆。先用一對(duì)重組載體轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞,7天后,再用另一對(duì)轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞,第2對(duì)轉(zhuǎn)染3天后,取培養(yǎng)細(xì)胞的2/3提取基因組DNA,對(duì)敲除位點(diǎn)附近的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增后通過(guò)DNA測(cè)序?qū)η贸蔬M(jìn)行分析,剩余細(xì)胞在96孔平板上通過(guò)有限稀釋法篩選YAF2敲除的細(xì)胞株。用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)初步鑒定YAF2蛋白質(zhì)表達(dá)缺失的細(xì)胞克隆,提取其基因組DNA,對(duì)敲除位點(diǎn)附近的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至p GEM-T easy載體,通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)YAF2基因純合敲除的細(xì)胞株。結(jié)果成功構(gòu)建兩對(duì)針對(duì)人YAF2基因第二外顯子的p X335-sgRNA質(zhì)粒;PCR產(chǎn)物測(cè)序證明兩對(duì)重組載體均有...

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材料與方法
結(jié)果
討論



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