目的:檢測晝夜節(jié)律基因CRY1與細(xì)胞自噬在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/DDP及其親本細(xì)胞株A2780中的表達差異,探討CRY1與細(xì)胞自噬的相關(guān)性及其是否參與A2780/DDP耐藥性的產(chǎn)生。方法:1.qRT-PCR及Western Blot檢測A2780及A2780/DDP細(xì)胞株中細(xì)胞自噬和晝夜節(jié)律基因及相關(guān)蛋白表達水平;細(xì)胞免疫熒光檢測LC3和CRY1的表達及分布情況。2.順鉑處理腫瘤細(xì)胞后,CCK8檢測細(xì)胞1⁵天的存活率;吖啶橙及Hoechst33342觀察自噬囊泡和細(xì)胞核形態(tài);Western Blot檢測自噬和晝夜節(jié)律基因表達。3.3-甲基腺嘌呤處理腫瘤細(xì)胞后,Western Blot檢測自噬和晝夜節(jié)律基因的表達變化。4.慢病毒介導(dǎo)CRY1干擾及過表達質(zhì)粒分別調(diào)控A2780和A2780/DDP細(xì)胞CRY1基因的表達水平;qRT-PCR和Western Blot檢測CRY1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞CRY1及細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白;CCK8比較調(diào)控CRY1前后細(xì)胞順鉑敏感性變化。結(jié)果:1.與A2780細(xì)胞相比,qRT-PCR結(jié)果顯示A2780/DDP中CRY1、CRY2、CLO...

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
縮略語及中英文對照
前言
材料
    1 實驗材料
    2 主要溶液及試劑配方
研究方法
    1 細(xì)胞培養(yǎng)
    2 Western Blot
    3 實時熒光定量PCR
    4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因細(xì)胞的構(gòu)建
    5 細(xì)胞存活率測定(CCK8 法)
    6 Hoechst33342 染色熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡
    7 吖啶橙染色檢測自噬囊泡
    8 細(xì)胞免疫熒光
    9 統(tǒng)計學(xué)分析
實驗結(jié)果
    1 卵巢癌細(xì)胞株A2780 及其順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/DDP的自噬活性和晝夜節(jié)律基因表達情況分析
        1.1 自噬相關(guān)基因及蛋白檢測
        1.2 免疫熒光法檢測LC3 表達情況
        1.3 晝夜節(jié)律基因及蛋白檢測
        1.4 免疫熒光法檢測CRY1蛋白表達情況
        1.5 小結(jié)
    2 A2780與A2780/DDP細(xì)胞株順鉑處理后的自噬活性與晝夜節(jié)律基因表達情況分析
        2.1 CCK8法檢測細(xì)胞的存活情況
        2.2 吖啶橙染色檢測細(xì)胞自噬活性
        2.3 Hoechst33342 染色法檢測細(xì)胞凋亡
        2.4 Western Blot檢測自噬相關(guān)蛋白和晝夜節(jié)律基因的表達情況
        2.5 小結(jié)
    3 抑制細(xì)胞自噬后A2780和A2780/DDP細(xì)胞晝夜節(jié)律基因CRY1表達情況
        3.1 使用細(xì)胞自噬抑制劑后檢測晝夜節(jié)律基因CRY1的表達
        3.2 小結(jié)
    4 調(diào)控A2780/DDP和 A2780 細(xì)胞中CRY1表達后細(xì)胞自噬及活性檢測
        4.1 細(xì)胞篩選濃度的確定
        4.2 病毒轉(zhuǎn)染MOI值的確定
        4.3 CRY1基因干擾序列的篩選以及干擾和過表達后晝夜節(jié)律基因檢測
        4.4 CRY1基因敲減及過表達后細(xì)胞自噬蛋白檢測
        4.5 CRY1基因敲減及過表達后細(xì)胞活性檢測
        4.6 小結(jié)
討論
    1 A2780/DDP細(xì)胞中CRY1蛋白表達水平低于A2780,自噬活性強于A2780
    2 順鉑影響晝夜節(jié)律基因CRY1的表達及自噬效應(yīng)
    3 自噬下調(diào)CRY1表達
    4 CRY1調(diào)控A2780/DDP的順鉑敏感性
結(jié)論
參考文獻
文獻綜述
    參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3807825