本文關(guān)鍵詞：LncRNA在卵巢癌耐藥細(xì)胞株中的篩選及作用機(jī)制的初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：卵巢惡性腫瘤具有起病隱匿、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、預(yù)后較差等特點(diǎn),是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,死亡率位居婦科惡性腫瘤之首,發(fā)病率居女性生殖器惡性腫瘤的第二位,僅次于宮頸癌。其發(fā)病率約22.9%,并以每年1%的速度遞增。在婦科惡性腫瘤中,最為常見的即上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC),占卵巢癌病例的85-90%。卵巢癌高發(fā)年齡在40~70歲間,患者5年生存率約30%。由于臨床癥狀不明顯,患者在出現(xiàn)嚴(yán)重腹痛或消化道癥狀時才就診,初診患者中有2/3已屬晚期,其中超過70%已有盆腔轉(zhuǎn)移或淋巴轉(zhuǎn)移。對于中晚期卵巢癌患者,化療是主要的治療手段之一。目前公認(rèn)的晚期卵巢癌標(biāo)準(zhǔn)化治療方案為“腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類藥物化療”,例如紫杉醇聯(lián)合鉑類化療在卵巢癌綜合治療中占有重要地位。其中,順鉑作為被廣泛應(yīng)用的一線化療藥物在眾多實體腫瘤中均具明顯的抗腫瘤療效。然而,腫瘤細(xì)胞的原發(fā)或繼發(fā)性耐藥是影響化療效果的重要因素,是造成腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因。隨著耐藥現(xiàn)象的不斷出現(xiàn),順鉑的療效漸不盡人意。鉑類耐藥可能由多種機(jī)制產(chǎn)生,其成因包括:腫瘤內(nèi)外環(huán)境改變、細(xì)胞藥物攝入減少、細(xì)胞解毒作用增強(qiáng)、DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、錯配修復(fù)減少、細(xì)胞凋亡通路受阻等。雖然鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療取得了新的進(jìn)展,但其5年生存率卻無明顯提高。而其中明確順鉑耐藥機(jī)制、尋找有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑對提高卵巢癌化療敏感性和調(diào)整治療方案具有重要的意義。與此同時,非編碼RNA在疾病發(fā)生機(jī)制和調(diào)控方面的重要性逐漸顯露。非編碼RNA參與眾多復(fù)雜疾病發(fā)生,例如sn RNA參與自體免疫性疾病如紅斑狼瘡發(fā)生,sno RNA與硬皮病相關(guān)等。另外,非編碼RNA與腫瘤發(fā)生或抑制的相關(guān)性也被一再證實,其變化很可能導(dǎo)致細(xì)胞異常和癌變。例如,mi R-15和mi R-16起著腫瘤抑制基因的作用,在人慢性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。作為非編碼RNA的重要一員,Lnc RNA異常調(diào)節(jié)參與包括胃癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤疾病發(fā)生。Lnc RNA表達(dá)水平的改變甚至是空間結(jié)構(gòu)變化都可引起一系列蛋白表達(dá)和信號變化,是癌癥發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)條件之一。例如,HOTAIR可介導(dǎo)的染色質(zhì)改變和癌癥轉(zhuǎn)移。HOTAIR與PRC2(polycomb repressive complex 2)的互作通過引起染色質(zhì)的三甲基化狀態(tài)改變加快癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。近年研究發(fā)現(xiàn),長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,Lnc RNAs)可能與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此,分析尋找與順鉑耐藥相關(guān)的Lnc RNAs,及深入探討Lnc RNAs在順鉑治療耐藥過程中的分子機(jī)制為卵巢癌的治療提供新的研究思路。研究擬以卵巢癌細(xì)胞A2780(順鉑敏感),CP70(順鉑耐藥)為研究對象,采用Lnc RNA及m RNA基因芯片差異分析、實時熒光定量PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測卵巢癌細(xì)胞中的Lnc RNA及m RNA基因表達(dá)變化,分析其與順鉑耐藥之間的關(guān)系,尋找與順鉑耐藥可能相關(guān)的基因。本研究將為尋找參與卵巢癌順鉑耐藥基因提供有力的實驗依據(jù),并為進(jìn)一步探討其在卵巢癌順鉑耐藥中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。實驗?zāi)康?1.觀察順鉑敏感細(xì)胞株A2780和耐藥細(xì)胞株CP70的Lnc RNA及m RNA的表達(dá)差異;2.分析篩選與順鉑耐藥相關(guān)的LncRNA;3.研究篩選出的LncRNA參與順鉑耐藥的內(nèi)在機(jī)制,為篩選特異Lnc RNA成為逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的分子靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。方法及內(nèi)容:1.以順鉑敏感細(xì)胞株A2780、耐藥細(xì)胞株CP70為研究對象,應(yīng)用Lnc RNA基因芯片差異分析、實時熒光定量PCR等觀察Lnc RNA在卵巢癌耐藥非耐藥細(xì)胞中的表達(dá)變化,分析Lnc RNA基因表達(dá)水平變化導(dǎo)致順鉑耐藥的分子機(jī)制。2.以A2780/CP70細(xì)胞為研究對象,應(yīng)用m RNA基因芯片差異分析、實時熒光定量PCR等觀察m RNA在卵巢癌耐藥非耐藥細(xì)胞中的表達(dá)變化,分析m RNA基因表達(dá)水平變化與順鉑耐藥的相關(guān)性。3.生物信息學(xué)分析比對Lnc RNA基因芯片與m RNA基因芯片差異表達(dá)基因,遴選特異的Lnc RNA。4.應(yīng)用實時熒光定量PCR驗證特異的Lnc RNA與m RNA表達(dá)水平相關(guān)性,分析Lnc RNA在參與順鉑耐藥過程中可能的耐藥機(jī)制。5.以順鉑耐藥細(xì)胞株CP70為研究對象,應(yīng)用si RNA技術(shù)沉默相關(guān)Lnc RNA基因,實時熒光定量PCR觀察轉(zhuǎn)染后特異基因的表達(dá),MTT法觀察特異Lnc RNA的si RNA對卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響,并分析其內(nèi)在的分子機(jī)制。實驗結(jié)果:1.Lnc RNA基因芯片分析結(jié)果顯示,Lnc RNA差異表達(dá)基因共1902條。CP70相對A2780高表達(dá)的Lnc RNA 1033條,CP70相對A2780低表達(dá)的Lnc RNA 869條。2倍以上升高共298條;2倍以上降低的共307條;5倍以上升高共14條;5倍以上降低的共11條。2.m RNA差異表達(dá)基因共1469條。CP70相對A2780高表達(dá)的m RNA 547條,CP70相對A2780低表達(dá)的m RNA共922條。2倍以上升高共167條;2倍以上降低的共298條;5倍以上升高共20條;5倍以上降低的共29條。3.實驗在相似細(xì)胞系SKOV3/SKOV3-DDP中進(jìn)行Lnc RNA的q PCR二次驗證,在RT-PCR的相關(guān)實驗結(jié)果中,我們篩選出可能與順鉑耐藥相關(guān)的5條Lnc RNA。4.選擇在兩組卵巢癌耐藥細(xì)胞系上調(diào)均明顯的LncRNA,命名為U2,設(shè)計并合成其序列特異性si RNA,對CP70順鉑耐藥株進(jìn)行si RNA轉(zhuǎn)染并觀察順鉑耐藥逆轉(zhuǎn)情況。結(jié)果顯示,Lnc RNA-U2基因沉默的CP70細(xì)胞對順鉑的敏感性有所恢復(fù)。5.我們將芯片結(jié)果錄入數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行了GO(Gene Ontology analysis)富集分析,在信號通路、分子功能、細(xì)胞定位方面進(jìn)行聚類統(tǒng)計。結(jié)果發(fā)現(xiàn),變化基因主要定位在細(xì)胞膜及細(xì)胞核內(nèi),行使包括胞間連接、細(xì)胞增殖調(diào)控的功能。其中,包括Bax/Bcl-2等基因發(fā)生表達(dá)變化。6.實驗分析了Lnc RNA-U2與Bax/Bcl-2的表達(dá)相關(guān)性,Western-blot發(fā)現(xiàn)下調(diào)卵巢癌耐藥細(xì)胞系CP70中的Lnc RNA-U2后,促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào),凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào),Bax/Bcl-2比例明顯提高。結(jié)論:1.Lnc RNA參與順鉑耐藥的發(fā)生,而通過基因芯片篩選和RT-PCR驗證后確定Lnc RNA-U2在順鉑耐藥轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用。2.LncRNA-U2促進(jìn)順鉑耐藥的作用可能是通過調(diào)控Bax/Bcl-2等細(xì)胞凋亡蛋白實現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：卵巢癌 LncRNA 順鉑耐藥 芯片分析
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-31
• 實驗一31-52
• 1 材料31-33
• 1.1 實驗試劑31
• 1.2 主要儀器31-32
• 1.3 主要溶液及配制32
• 1.4 細(xì)胞及研究對象32-33
• 2 方法33-39
• 2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代、保存33-34
• 2.2 細(xì)胞總RNA的提取34-35
• 2.3 細(xì)胞總RNA的純化與質(zhì)量控制35-36
• 2.4 細(xì)胞LncRNA/mRNA的基因芯片分析36-38
• 2.5 實時熒光定量PCR檢測差異LncRNA的表達(dá)38-39
• 2.6 生物信息學(xué)分析39
• 3 結(jié)果39-49
• 3.1 細(xì)胞總RNA的提取及鑒定39-41
• 3.2 LncRNA/mRNA的基因芯片分析結(jié)果41-45
• 3.3 RT-PCR引物PCR反應(yīng)條件檢驗45-46
• 3.4 顯著下調(diào)LncRNA的RT-PCR驗證46-48
• 3.5 顯著上調(diào)LncRNA的RT-PCR驗證48-49
• 4 討論49-52
• 實驗二52-65
• 1 材料52-55
• 1.1 實驗試劑52-53
• 1.2 主要儀器53-54
• 1.3 主要溶液及配制54-55
• 1.4 細(xì)胞及研究對象55
• 2 方法55-58
• 2.1 LncRNA-U2 siRNA合成及細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗55
• 2.2 RT-PCR檢測siRNA對LncRNA-U2表達(dá)抑制效率55-56
• 2.3 MTT法檢測卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性逆轉(zhuǎn)實驗56
• 2.4 檢測U2對細(xì)胞遷移活性的影響56-57
• 2.5 western blot檢測U2與細(xì)胞凋亡蛋白相關(guān)性57-58
• 3 結(jié)果58-63
• 3.1 siRNA抑制LncRNA效率的檢測58
• 3.2 MTT法檢測卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性逆轉(zhuǎn)58-61
• 3.3 western blot檢測LncNA-U2對細(xì)胞凋亡信號相關(guān)蛋白的表達(dá)影響61
• 3.4 檢測LncRNA-U2對細(xì)胞遷移活性的影響61-63
• 4 討論63-65
• 小結(jié)65-68
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 附錄73-77
• 個人簡歷和研究成果77-79
• 致謝79

【相似文獻(xiàn)】

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