本文關(guān)鍵詞：LncRNA在卵巢癌耐藥細(xì)胞株中的篩選及作用機(jī)制的初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：卵巢惡性腫瘤具有起病隱匿、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、預(yù)后較差等特點(diǎn),是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,死亡率位居?jì)D科惡性腫瘤之首,發(fā)病率居女性生殖器惡性腫瘤的第二位,僅次于宮頸癌。其發(fā)病率約22.9%,并以每年1%的速度遞增。在婦科惡性腫瘤中,最為常見的即上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC),占卵巢癌病例的85-90%。卵巢癌高發(fā)年齡在40~70歲間,患者5年生存率約30%。由于臨床癥狀不明顯,患者在出現(xiàn)嚴(yán)重腹痛或消化道癥狀時(shí)才就診,初診患者中有2/3已屬晚期,其中超過70%已有盆腔轉(zhuǎn)移或淋巴轉(zhuǎn)移。對(duì)于中晚期卵巢癌患者,化療是主要的治療手段之一。目前公認(rèn)的晚期卵巢癌標(biāo)準(zhǔn)化治療方案為“腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類藥物化療”,例如紫杉醇聯(lián)合鉑類化療在卵巢癌綜合治療中占有重要地位。其中,順鉑作為被廣泛應(yīng)用的一線化療藥物在眾多實(shí)體腫瘤中均具明顯的抗腫瘤療效。然而,腫瘤細(xì)胞的原發(fā)或繼發(fā)性耐藥是影響化療效果的重要因素,是造成腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因。隨著耐藥現(xiàn)象的不斷出現(xiàn),順鉑的療效漸不盡人意。鉑類耐藥可能由多種機(jī)制產(chǎn)生,其成因包括:腫瘤內(nèi)外環(huán)境改變、細(xì)胞藥物攝入減少、細(xì)胞解毒作用增強(qiáng)、DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、錯(cuò)配修復(fù)減少、細(xì)胞凋亡通路受阻等。雖然鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療取得了新的進(jìn)展,但其5年生存率卻無明顯提高。而其中明確順鉑耐藥機(jī)制、尋找有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑對(duì)提高卵巢癌化療敏感性和調(diào)整治療方案具有重要的意義。與此同時(shí),非編碼RNA在疾病發(fā)生機(jī)制和調(diào)控方面的重要性逐漸顯露。非編碼RNA參與眾多復(fù)雜疾病發(fā)生,例如sn RNA參與自體免疫性疾病如紅斑狼瘡發(fā)生,sno RNA與硬皮病相關(guān)等。另外,非編碼RNA與腫瘤發(fā)生或抑制的相關(guān)性也被一再證實(shí),其變化很可能導(dǎo)致細(xì)胞異常和癌變。例如,mi R-15和mi R-16起著腫瘤抑制基因的作用,在人慢性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。作為非編碼RNA的重要一員,Lnc RNA異常調(diào)節(jié)參與包括胃癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤疾病發(fā)生。Lnc RNA表達(dá)水平的改變甚至是空間結(jié)構(gòu)變化都可引起一系列蛋白表達(dá)和信號(hào)變化,是癌癥發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)條件之一。例如,HOTAIR可介導(dǎo)的染色質(zhì)改變和癌癥轉(zhuǎn)移。HOTAIR與PRC2(polycomb repressive complex 2)的互作通過引起染色質(zhì)的三甲基化狀態(tài)改變加快癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。近年研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,Lnc RNAs)可能與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此,分析尋找與順鉑耐藥相關(guān)的Lnc RNAs,及深入探討Lnc RNAs在順鉑治療耐藥過程中的分子機(jī)制為卵巢癌的治療提供新的研究思路。研究擬以卵巢癌細(xì)胞A2780(順鉑敏感),CP70(順鉑耐藥)為研究對(duì)象,采用Lnc RNA及m RNA基因芯片差異分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞中的Lnc RNA及m RNA基因表達(dá)變化,分析其與順鉑耐藥之間的關(guān)系,尋找與順鉑耐藥可能相關(guān)的基因。本研究將為尋找參與卵巢癌順鉑耐藥基因提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為進(jìn)一步探討其在卵巢癌順鉑耐藥中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.觀察順鉑敏感細(xì)胞株A2780和耐藥細(xì)胞株CP70的Lnc RNA及m RNA的表達(dá)差異;2.分析篩選與順鉑耐藥相關(guān)的LncRNA;3.研究篩選出的LncRNA參與順鉑耐藥的內(nèi)在機(jī)制,為篩選特異Lnc RNA成為逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的分子靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。方法及內(nèi)容:1.以順鉑敏感細(xì)胞株A2780、耐藥細(xì)胞株CP70為研究對(duì)象,應(yīng)用Lnc RNA基因芯片差異分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等觀察Lnc RNA在卵巢癌耐藥非耐藥細(xì)胞中的表達(dá)變化,分析Lnc RNA基因表達(dá)水平變化導(dǎo)致順鉑耐藥的分子機(jī)制。2.以A2780/CP70細(xì)胞為研究對(duì)象,應(yīng)用m RNA基因芯片差異分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等觀察m RNA在卵巢癌耐藥非耐藥細(xì)胞中的表達(dá)變化,分析m RNA基因表達(dá)水平變化與順鉑耐藥的相關(guān)性。3.生物信息學(xué)分析比對(duì)Lnc RNA基因芯片與m RNA基因芯片差異表達(dá)基因,遴選特異的Lnc RNA。4.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證特異的Lnc RNA與m RNA表達(dá)水平相關(guān)性,分析Lnc RNA在參與順鉑耐藥過程中可能的耐藥機(jī)制。5.以順鉑耐藥細(xì)胞株CP70為研究對(duì)象,應(yīng)用si RNA技術(shù)沉默相關(guān)Lnc RNA基因,實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察轉(zhuǎn)染后特異基因的表達(dá),MTT法觀察特異Lnc RNA的si RNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響,并分析其內(nèi)在的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.Lnc RNA基因芯片分析結(jié)果顯示,Lnc RNA差異表達(dá)基因共1902條。CP70相對(duì)A2780高表達(dá)的Lnc RNA 1033條,CP70相對(duì)A2780低表達(dá)的Lnc RNA 869條。2倍以上升高共298條;2倍以上降低的共307條;5倍以上升高共14條;5倍以上降低的共11條。2.m RNA差異表達(dá)基因共1469條。CP70相對(duì)A2780高表達(dá)的m RNA 547條,CP70相對(duì)A2780低表達(dá)的m RNA共922條。2倍以上升高共167條;2倍以上降低的共298條;5倍以上升高共20條;5倍以上降低的共29條。3.實(shí)驗(yàn)在相似細(xì)胞系SKOV3/SKOV3-DDP中進(jìn)行Lnc RNA的q PCR二次驗(yàn)證,在RT-PCR的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,我們篩選出可能與順鉑耐藥相關(guān)的5條Lnc RNA。4.選擇在兩組卵巢癌耐藥細(xì)胞系上調(diào)均明顯的LncRNA,命名為U2,設(shè)計(jì)并合成其序列特異性si RNA,對(duì)CP70順鉑耐藥株進(jìn)行si RNA轉(zhuǎn)染并觀察順鉑耐藥逆轉(zhuǎn)情況。結(jié)果顯示,Lnc RNA-U2基因沉默的CP70細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性有所恢復(fù)。5.我們將芯片結(jié)果錄入數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行了GO(Gene Ontology analysis)富集分析,在信號(hào)通路、分子功能、細(xì)胞定位方面進(jìn)行聚類統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),變化基因主要定位在細(xì)胞膜及細(xì)胞核內(nèi),行使包括胞間連接、細(xì)胞增殖調(diào)控的功能。其中,包括Bax/Bcl-2等基因發(fā)生表達(dá)變化。6.實(shí)驗(yàn)分析了Lnc RNA-U2與Bax/Bcl-2的表達(dá)相關(guān)性,Western-blot發(fā)現(xiàn)下調(diào)卵巢癌耐藥細(xì)胞系CP70中的Lnc RNA-U2后,促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào),凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào),Bax/Bcl-2比例明顯提高。結(jié)論:1.Lnc RNA參與順鉑耐藥的發(fā)生,而通過基因芯片篩選和RT-PCR驗(yàn)證后確定Lnc RNA-U2在順鉑耐藥轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用。2.LncRNA-U2促進(jìn)順鉑耐藥的作用可能是通過調(diào)控Bax/Bcl-2等細(xì)胞凋亡蛋白實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：卵巢癌 LncRNA 順鉑耐藥 芯片分析
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.31
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-31
• 實(shí)驗(yàn)一31-52
• 1 材料31-33
• 1.1 實(shí)驗(yàn)試劑31
• 1.2 主要儀器31-32
• 1.3 主要溶液及配制32
• 1.4 細(xì)胞及研究對(duì)象32-33
• 2 方法33-39
• 2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代、保存33-34
• 2.2 細(xì)胞總RNA的提取34-35
• 2.3 細(xì)胞總RNA的純化與質(zhì)量控制35-36
• 2.4 細(xì)胞LncRNA/mRNA的基因芯片分析36-38
• 2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)差異LncRNA的表達(dá)38-39
• 2.6 生物信息學(xué)分析39
• 3 結(jié)果39-49
• 3.1 細(xì)胞總RNA的提取及鑒定39-41
• 3.2 LncRNA/mRNA的基因芯片分析結(jié)果41-45
• 3.3 RT-PCR引物PCR反應(yīng)條件檢驗(yàn)45-46
• 3.4 顯著下調(diào)LncRNA的RT-PCR驗(yàn)證46-48
• 3.5 顯著上調(diào)LncRNA的RT-PCR驗(yàn)證48-49
• 4 討論49-52
• 實(shí)驗(yàn)二52-65
• 1 材料52-55
• 1.1 實(shí)驗(yàn)試劑52-53
• 1.2 主要儀器53-54
• 1.3 主要溶液及配制54-55
• 1.4 細(xì)胞及研究對(duì)象55
• 2 方法55-58
• 2.1 LncRNA-U2 siRNA合成及細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)55
• 2.2 RT-PCR檢測(cè)siRNA對(duì)LncRNA-U2表達(dá)抑制效率55-56
• 2.3 MTT法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)56
• 2.4 檢測(cè)U2對(duì)細(xì)胞遷移活性的影響56-57
• 2.5 western blot檢測(cè)U2與細(xì)胞凋亡蛋白相關(guān)性57-58
• 3 結(jié)果58-63
• 3.1 siRNA抑制LncRNA效率的檢測(cè)58
• 3.2 MTT法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性逆轉(zhuǎn)58-61
• 3.3 western blot檢測(cè)LncNA-U2對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)相關(guān)蛋白的表達(dá)影響61
• 3.4 檢測(cè)LncRNA-U2對(duì)細(xì)胞遷移活性的影響61-63
• 4 討論63-65
• 小結(jié)65-68
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 附錄73-77
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果77-79
• 致謝79

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 魯慧英;Detection of hepatitis C virus RNA sequences in cholangiocarcinomas in Chinese and American patients[J];Chinese Medical Journal;2000年12期

2 ;Detection the HCV RNA by PCR-microplate hybridization method from clinical specimens[J];中國(guó)輸血雜志;2001年S1期

3 付漢江,鄭曉飛;類mRNA RNA研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));2002年04期

4 Verheyden B ,徐其武;口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗核殼和RNA的穩(wěn)定性[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊(cè);2002年01期

5 CMBE譯文組;探索小RNA的功能[J];現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志;2004年03期

6 沈維干;RNA interference and its current application in mammals[J];Chinese Medical Journal;2004年07期

7 ;Potent and specific inhibition of SARS-CoV antigen expression by RNA interference[J];Chinese Medical Journal;2005年09期

8 孫娣;汪洋;張麗娟;閆玉清;;一種簡(jiǎn)捷提取植物總RNA的方法[J];黑龍江醫(yī)藥;2005年06期

9 熊慧華;于世英;胡廣原;莊亮;;Effects of Survivin Expression Suppressed by Short Hairpin RNA on MCF-7 Cells[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2006年03期

10 楊益超;;RNA干擾及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J];廣西醫(yī)學(xué);2007年10期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 金由辛;;面向21世紀(jì)的RNA研究[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展（下冊(cè)）[C];1999年

2 ;第四屆RNA全國(guó)研討會(huì)大會(huì)報(bào)告日程安排[A];第四屆全國(guó)RNA進(jìn)展研討會(huì)論文集[C];2005年

3 ;Function of Transfer RNA Modifications in Plant Development[A];植物分子生物學(xué)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)——全國(guó)植物生物學(xué)研討會(huì)論文摘要集[C];2010年

4 王峰;張秋平;陳金湘;;棉花總RNA的快速提取方法[A];中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2011年年會(huì)論文匯編[C];2011年

5 關(guān)力;陳本iY;iJ云虹;郭培芝;魏重琴;邱蘇吾;苗健;;關(guān)于動(dòng)物}D~T中RNAn,定方法的研究[A];中國(guó)生理科學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編（生物化學(xué)）[C];1964年

6 夏海濱;;小RNA在免疫學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用研究進(jìn)展[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第五屆全國(guó)代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

7 ;The stability of hepatitis C virus RNA in various handling and storage conditions[A];中國(guó)輸血協(xié)會(huì)第四屆輸血大會(huì)論文集[C];2006年

8 郭德銀;;RNA干擾在病毒研究和控制中的應(yīng)用[A];2006中國(guó)微生物學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2006年

9 甘儀梅;楊業(yè)華;王學(xué)奎;曹燕;楊特武;;棉花總RNA快速提取[A];中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2007年年會(huì)論文匯編[C];2007年

10 ;Identification and characterization of novel interactive partner proteins for PCBP1 that is a RNA-binding protein[A];中國(guó)優(yōu)生優(yōu)育協(xié)會(huì)第四屆全國(guó)學(xué)術(shù)論文報(bào)告會(huì)暨基因科學(xué)高峰論壇論文專輯[C];2008年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 馮衛(wèi)東;研究人員發(fā)現(xiàn)可破壞腫瘤抑制基因的小RNA[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

2 記者 儲(chǔ)笑抒 通訊員 盛偉;人體微小RNA有望提前發(fā)出癌癥預(yù)警[N];南京日?qǐng)?bào);2011年

3 瀘州醫(yī)學(xué)院副教授、科普作家 周志遠(yuǎn);“大頭兒子”與環(huán)狀RNA[N];第一財(cái)經(jīng)日?qǐng)?bào);2014年

4 麥迪信;小分子RNA可能有大作用[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2003年

5 董映璧;美發(fā)現(xiàn)基因調(diào)控可回應(yīng)“RNA世界”[N];科技日?qǐng)?bào);2006年

6 張忠霞;特制RNA輕推一下,就能“喚醒”基因[N];新華每日電訊;2007年

7 聶翠蓉;RNA：縱是配角也精彩[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

8 馮衛(wèi)東;RNA干擾機(jī)制首次在人體中獲得證實(shí)[N];科技日?qǐng)?bào);2010年

9 馮衛(wèi)東　王小龍;英在地球早期環(huán)境模擬條件下合成類RNA[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

10 記者 常麗君;新技術(shù)讓研究進(jìn)入單細(xì)胞內(nèi)RNA的世界[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王趙瑋;昆蟲RNA病毒復(fù)制及昆蟲抗病毒天然免疫機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2014年

2 包純;一類新非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)以及產(chǎn)生和功能的初探[D];華中師范大學(xué);2015年

3 李語麗;基于MeRIP-seq的水稻RNA m6A甲基化修飾的研究[D];中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所;2015年

4 熊瑜琳;miR-122靶位基因STAT3調(diào)控長(zhǎng)鏈非編碼 RNA Lethe促進(jìn)HCV復(fù)制的機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 范春節(jié);高通量測(cè)序鑒定毛竹小RNA及其功能分析[D];中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院;2012年

6 王加強(qiáng);小鼠著床前胚胎特異ERV相關(guān)長(zhǎng)非編碼RNA的定向篩選及功能研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 王業(yè)偉;非編碼RNA SPIU的結(jié)構(gòu)和功能研究和p19INK4D在APL發(fā)病中的作用[D];上海交通大學(xué);2013年

8 鄒艷芬;子癇前期中非編碼RNA對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控及機(jī)制探索[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

9 朱喬;miR-10b在人肝細(xì)胞肝癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制的初步探索[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

10 蔣俊鋒;長(zhǎng)鏈非編碼RNA BACE1-AS促進(jìn)Aβ聚集及其調(diào)節(jié)BACE1和SERF1a的ceRNA機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陸聰兒;條紋斑竹鯊再生肝臟中差異RNA的研究[D];浙江理工大學(xué);2015年

2 張曉輝;小鼠幾種長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因功能的初步研究[D];昆明理工大學(xué);2015年

3 全弘揚(yáng);長(zhǎng)鏈非編碼RNA在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中的相關(guān)作用及機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

4 胡亮;DDX19A識(shí)別PRRSV基因組RNA并激活NLRP3炎癥小體[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

5 張帥兵;應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對(duì)旋毛蟲Nudix水解酶基因功能的研究[D];鄭州大學(xué);2015年

6 鄭芳芳;肺癌RNA-Seq數(shù)據(jù)中RNA編輯事件的識(shí)別算法和系統(tǒng)分析[D];蘇州大學(xué);2015年

7 陳瑞東;長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2015年

8 劉駿武;線蟲和水稻中環(huán)狀RNA的預(yù)測(cè)及分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 李猷;利用RNA干擾技術(shù)提高番茄抗TMV侵染能力的研究[D];牡丹江師范學(xué)院;2015年

10 吳術(shù)盛;SVCV感染EPC細(xì)胞microRNA表達(dá)譜的初步研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：LncRNA在卵巢癌耐藥細(xì)胞株中的篩選及作用機(jī)制的初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：379359