本文關(guān)鍵詞：新基因F10參與滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤病理機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞入侵母體子宮組織,引起母體螺旋血管重構(gòu),對胎盤發(fā)育和妊娠過程的順利進(jìn)行必不可少。與腫瘤不同的是,間質(zhì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲深度不超過蛻膜和子宮肌層的外三分之一,滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲程度是由滋養(yǎng)層細(xì)胞和母體以時(shí)空的方式精確調(diào)控的。滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過程失衡會導(dǎo)致各種疾病,若絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞過度增殖并向子宮基質(zhì)縱向侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,則可導(dǎo)致侵襲性葡萄胎、絨癌等滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)生。滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入調(diào)控機(jī)制的研究,有望為腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的機(jī)理研究提供新的突破。細(xì)胞過度增殖是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ),相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移與細(xì)胞外基質(zhì)的過度降解密不可分。近年來,隨著人們對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲調(diào)控過程的深入研究,越來越多的侵襲調(diào)控因子及信號通路被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)參與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過程。其中基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑、尿激酶型纖溶酶原激活劑及其抑制劑是影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲程度的重要調(diào)節(jié)因子,可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,參與滋養(yǎng)細(xì)胞侵入調(diào)控過程。信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3及C-Jun氨基末端激酶是信號傳導(dǎo)途徑中重要的核轉(zhuǎn)錄因子,已有文獻(xiàn)報(bào)道,活化的信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3及C-Jun氨基末端激酶可直接或間接地參與調(diào)控絨癌細(xì)胞增殖和侵潤過程。但目前對滋養(yǎng)細(xì)胞侵入調(diào)控過程中引起這些侵襲調(diào)控因子及信號激酶變化的上游效應(yīng)因子我們知之甚少。F10基因是課題組前期通過抑制性消減雜交法從正常早孕絨毛膜組織與葡萄胎組織中分離鑒定出一種功能未明的新基因。F10基因在葡萄胎組織、侵蝕性葡萄胎、絨癌中均陽性表達(dá)且依次增強(qiáng),提示F10與滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。通過采用GFP作為標(biāo)記物來觀察F10基因表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的分布和定位,結(jié)果表明在細(xì)胞分裂中期,F10基因定位于細(xì)胞核,這可能與紡錘體的形成有關(guān)；在細(xì)胞分裂間期,F10出核至細(xì)胞器,作用于微管蛋白,這提示F10基因可能是參與遺傳信息調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子,因此我們初步推測F10基因不僅與滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤密切相關(guān),還有可能作為一種癌基因參與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。那么F10基因是否可通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶等侵襲相關(guān)因子及信號激酶的表達(dá)來參與滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移?目前關(guān)于F10在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用尚無研究及報(bào)道。本研究采用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù),分別構(gòu)建真核質(zhì)粒表達(dá)載體及RNAi慢病毒載體,設(shè)計(jì)并構(gòu)建重組體,將重組體分別轉(zhuǎn)染到絨癌細(xì)胞系,經(jīng)篩選及包裝,獲得F10基因穩(wěn)定過表達(dá)及沉默的絨癌細(xì)胞,并用F10基因穩(wěn)定過表達(dá)和沉默絨癌細(xì)胞株制備絨癌裸鼠皮下腫瘤模型,模擬人體內(nèi)環(huán)境,在活體動物上直觀地觀察F10基因過表達(dá)和基因沉默對絨癌細(xì)胞系成瘤性的影響；之后收集裸鼠皮下絨癌組織,分別檢測不同組絨癌組織中相關(guān)周期蛋白的表達(dá)水平,揭示F10與滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系,同時(shí)檢測不同組間基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑及纖溶酶原激活物抑制劑等侵襲相關(guān)因子的表達(dá)水平,探討F10基因在絨癌細(xì)胞侵入調(diào)控中的作用。最后,通過檢測不同組絨癌組織中相關(guān)信號激酶的表達(dá)差異,研究F10基因干預(yù)后絨癌細(xì)胞中信號蛋白酶的活性變化。以上研究對探討滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義,并為將來發(fā)展基于新基因F10的腫瘤防治措施提供理論支持。第一章滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤動物模型的成功構(gòu)建目的為探討葡萄胎病理相關(guān)新基因F10對絨癌細(xì)胞系成瘤性的影響,我們通過基因轉(zhuǎn)染及基因沉默技術(shù),獲得F10基因穩(wěn)定過表達(dá)及沉默的絨癌細(xì)胞系JEG-3、BEWO,并用F10基因穩(wěn)定過表達(dá)和沉默絨癌細(xì)胞株制備裸鼠絨癌動物模型,觀察裸鼠皮下腫瘤生長情況,并通過檢測成瘤組織中F10的表達(dá)水平,以驗(yàn)證F10蛋白在過表達(dá)組、沉默組及正常對照組中的表達(dá)差異,從而確認(rèn)動物模型構(gòu)建的成功,初步探討F10基因與絨癌細(xì)胞致瘤性的關(guān)系。方法針對F10基因分別設(shè)計(jì)并構(gòu)建F10基因穩(wěn)定過表達(dá)及沉默的絨癌細(xì)胞JEG-3、JAR單克隆細(xì)胞和F10沉默處理的BEWO細(xì)胞,而未處理的JEG-3、JAR、 BEWO細(xì)胞作為正常對照組。經(jīng)體外培養(yǎng)后,收集對數(shù)生長期細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液。將80只裸鼠隨機(jī)均分為JEG-3 F10過表達(dá)組、JEG-3對照組和JEG-3 F10沉默組；JAR F10過表達(dá)組、JAR對照組和JAR F10沉默組；BEWO對照組和BEWO F10沉默組(n=10),以75%乙醇消毒裸鼠局部皮膚,1ml無菌注射器吸取預(yù)先制備的細(xì)胞懸液(0.2ml/只,含細(xì)胞5×107個(gè))接種于動物頸背部皮下。觀察皮下成瘤情況,記錄裸鼠腫瘤發(fā)生時(shí)間；計(jì)算各組裸鼠的成瘤率；繪制在體腫瘤生長曲線；細(xì)胞接種5周后處死小鼠,取瘤組織稱重,比較各組瘤體重量。收集各組瘤體組織,通過免疫組化法及Western blot法檢測F10分別在JEG-3、JAR, BEWO各組腫瘤組織中的表達(dá)情況。所有數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,在體腫瘤生長曲線的比較采用重復(fù)測量方差分析。多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、裸鼠皮下腫瘤的成瘤時(shí)間、成瘤率及瘤體重量1.1 JEG-3三組成瘤率均為100%(10/10)。單因素方差分析顯示：三組的成瘤時(shí)間(分別為7±2.49d、6.3±0.67d、6.2±0.78d)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.781,P=0.468)。三組腫瘤重量(分別為571.1±221.10mg、354.5±116.23mg、 136.2±66.25mg),存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=21.199, P=0.000)。JEG-3 F10過表達(dá)組體重均較JEG-3 F10沉默組、JEG-3對照組重,JEG-3對照組較JEG-3 F10沉默組重。1.2 JAR三組成瘤率均為100%(10/10)。單因素方差分析顯示：三組的成瘤時(shí)間(分別為4.0±1.07d、4.4±1.07d、4.6±1.35d)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.097,P=0.908)。三組腫瘤重量(分別為607.49±216.19mg、423.87±74.75mg、 270.73±81.53mg),存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=14.462, P=0.000)。JAR F10過表達(dá)組體重均較JAR F10沉默組、JAR對照組重,JAR對照組較JAR F10沉默組重。1.3 BEWO兩組成瘤率均為100%(10/10)。兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示:兩組的成瘤時(shí)間(分別為4.5±1.43d、4.1±1.29d)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.657,P=0.520)。兩組腫瘤重量(分別為118.50±22.53mg、85.90±20.41mg),存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-3.339,P=0.004)。BEWO對照組較BEWO F10沉默組重。2、裸鼠皮下腫瘤在體生長速度分析2.1 JEG-3三組在不同時(shí)間點(diǎn)的成瘤體積進(jìn)行重復(fù)測量方差分析顯示,組間主效應(yīng)(不同時(shí)間的數(shù)據(jù)與各組的數(shù)據(jù))差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=136.311,P=0.000)。將各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析發(fā)現(xiàn),JEG-3 F10沉默組、JEG-3對照組、JEG-3 F10過表達(dá)組在不同時(shí)間點(diǎn)的成瘤體積差異顯著(F=68.548,P=0.000),時(shí)間與組間的交互效應(yīng)差異顯著(F=16.011,P=0.000)。LSD-t多重比較顯示,JEG-3對照組腫瘤在體生長速度明顯快于JEG-3 F10沉默組,JEG-3 F10過表達(dá)組在體生長速度明顯快于JEG-3對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。2.2 JAR三組在不同時(shí)間點(diǎn)的成瘤體積進(jìn)行重復(fù)測量方差分析顯示,組間主效應(yīng)(不同時(shí)間的數(shù)據(jù)與各組的數(shù)據(jù))差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=163.623,P=0.000)。將各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析發(fā)現(xiàn),JAR F10沉默組、JAR對照組、JAR F10過表達(dá)組在不同時(shí)間點(diǎn)的成瘤體積差異顯著(F=37.639,P=0.000),時(shí)間與組間的交互效應(yīng)差異顯著(F=8.133, P=0.000)。LSD-t多重比較顯示,JAR對照組腫瘤在體生長速度明顯快于JAR F10沉默組,JAR F10過表達(dá)組在體生長速度明顯快于JAR對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。2.3 BEWO兩組在不同時(shí)間點(diǎn)的成瘤體積進(jìn)行重復(fù)測量方差分析顯示,組間主效應(yīng)(不同時(shí)間的數(shù)據(jù)與各組的數(shù)據(jù))差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=114.995,P=0.000)。將各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析發(fā)現(xiàn),BEWO F10沉默組、BEWO對照組在不同時(shí)間點(diǎn)的成瘤體積差異顯著(F=16.869,P=0.001),時(shí)間與組間的交互效應(yīng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.618,P=0.093)。LSD-t多重比較顯示,BEWO對照組腫瘤在體生長速度明顯快于BEWO F10沉默組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。3、F10在各組成瘤組織中的表達(dá)驗(yàn)證3.1免疫組化法檢測F10在JEG-3、JAR、BEWO各組腫瘤組織中的表達(dá)情況3.1.1免疫組化結(jié)果顯示,F10在JEG-3 F10過表達(dá)組、F10沉默組、正常對照組腫瘤組織中的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異((F=15.405,P=0.008)。與正常對照組相比,JEG-3 F10過表達(dá)組F10蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng)(P0.05),JEG-3 F10沉默組F10蛋白表達(dá)水平降低(P0.05)。3.1.2免疫組化半定量結(jié)果顯示,F10在JAR F10過表達(dá)組、正常對照組、F10沉默組腫瘤組織中的表達(dá)水平依次降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=144.644,P0.001)。3.1.3對BEWO F10沉默組、正常對照組腫瘤組織行免疫組化驗(yàn)證,半定量結(jié)果顯示,與對照組相比,F10沉默組中F10的表達(dá)水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.2 Western blot檢測F10在JEG-3、JAR、BEWO各組腫瘤組織中的表達(dá)情況3.2.1對JEG-3三組腫瘤組織行Western blot驗(yàn)證,結(jié)果提示F10蛋白條帶灰度值在過表達(dá)組強(qiáng)度最高,其次分別為正常對照組及F10沉默組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。3.2.2 Western blot半定量結(jié)果顯示,與正常對照組相比,JAR F10過表達(dá)組F10表達(dá)水平明顯增強(qiáng),JAR F10沉默組F10表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。3.2.3 Western blot結(jié)果顯示,F10在BEWO F10沉默組及正常對照組中存在表達(dá)差異,F10蛋白條帶灰度值在F10沉默組強(qiáng)度較低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常對照組相比,經(jīng)F10過表達(dá)處理的絨癌細(xì)胞JEG-3、JAR成瘤后腫瘤的生長速度明顯增快,瘤體重量增加,經(jīng)F10沉默處理的絨癌細(xì)胞JEG-3、JAR、BEWO成瘤后的腫瘤生長速度明顯減慢,瘤體重量減輕,提示F10基因可能與絨癌細(xì)胞系的增殖調(diào)節(jié)有關(guān),可增強(qiáng)絨癌細(xì)胞系在裸鼠體內(nèi)的致瘤性。F10過表達(dá)及沉默組與正常對照組的成瘤率及成瘤時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明各組接種細(xì)胞數(shù)量一致(排除人為誤差)。通過免疫組化及Western bolt檢測腫瘤組織中F10的表達(dá)差異,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,與正常對照組相比,JEG-3、JAR F10過表達(dá)組中F10蛋白表達(dá)增加,JEG-3、JAR、BEWO沉默組中F10蛋白表達(dá)顯著降低,提示各組成瘤組織中F10表達(dá)差異與經(jīng)F10過表達(dá)及沉默處理的絨癌細(xì)胞一致,從而確認(rèn)JEG-3、JAR、BEWO三種絨癌細(xì)胞系制備裸鼠皮下腫瘤模型成功。第二章F10基因干預(yù)前后滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤增殖活性的變化目的如前所述,經(jīng)F10過表達(dá)和沉默處理后的絨癌細(xì)胞系JEG-3、JAR、BEWO制備裸鼠皮下成瘤動物模型,在F10過表達(dá)組、對照組及F10沉默組中F10蛋白的表達(dá)差異已得到驗(yàn)證,動物模型構(gòu)建成功。F10過表達(dá)處理的絨癌細(xì)胞成瘤后腫瘤生長速度加快,而F10沉默組的絨癌細(xì)胞成瘤后腫瘤生長速度顯著降低,說明F10可促進(jìn)絨癌細(xì)胞的增殖,滋養(yǎng)細(xì)胞過度增殖是影響其侵潤深度的重要因素。那么,F10是否可通過調(diào)節(jié)其增殖及凋亡而改變滋養(yǎng)細(xì)胞的侵潤能力?本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測成瘤后組織中相關(guān)周期蛋白的表達(dá)差異,進(jìn)一步探討其對腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法動物模型構(gòu)建成功后,收集各組腫瘤組織,通過免疫組化法及Western blot檢測以上獲得的動物模型腫瘤組織中PCNA、CyclinE、CDK、Caspase-3蛋白的表達(dá)差異。所有數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)：兩組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、免疫組化法檢測PCNA、CyclinE1、CDK、Caspase-3蛋白在JEG-3、JAR、 BEWO各組腫瘤組織中的表達(dá)情況1.1 JEG-3.JAR兩種絨癌細(xì)胞形成的腫瘤組織免疫組化結(jié)果顯示,CyclinE1、CDK在F10沉默組、對照組、F10過表達(dá)組中的表達(dá)水平依次增強(qiáng)(P0.001),相反,Caspase-3在F10沉默組中表達(dá)最強(qiáng),其次是對照組、F10過表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。1.2 BEWO組腫瘤組織的免疫組化結(jié)果顯示,在F10沉默組中,CyclinE1、CDK的表達(dá)水平顯著低于正常對照組(P0.001),Caspase-3蛋白的表達(dá)顯著高于對照組(P0.001)1.3我們還分別對JEG-3、JAR、BEWO各組腫瘤組織中的PCNA蛋白進(jìn)行免疫組化染色,半定量結(jié)果顯示,F10過表達(dá)組、對照組及F10沉默組中其表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2、Western blot檢測PCNA、CyclinE1、CDK、Caspase-3蛋白在JEG-3、JAR、 BEWO各組腫瘤組織中的表達(dá)情況2.1 JEG-3、JAR絨癌細(xì)胞皮下成瘤組織中Western blot檢測結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致,CyclinE1、CDK在F10過表達(dá)組中的表達(dá)強(qiáng)度最高,其次是對照組、F10沉默組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)；相反,F10沉默組中Caspase-3條帶粗且強(qiáng)度高,半定量結(jié)果顯示,Caspase-3在F10沉默組、對照組、F10過表達(dá)組表達(dá)強(qiáng)度依次遞減,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。2.2 BEWO組腫瘤組織Western blot結(jié)果顯示,F10沉默組CyclinE1、CDK條帶細(xì)且強(qiáng)度低,與對照組相比,沉默組CyclinE1、CDK蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P0.001)。而F10沉默組Caspase-3的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。2.3 Western blot分別對JEG-3、JAR、BEWO各組腫瘤組織中的PCNA蛋白進(jìn)行檢測,半定量結(jié)果顯示,F10過表達(dá)組、對照組、F10沉默組中PCNA表達(dá)強(qiáng)度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論JEG-3.JAR.BEWO三種絨癌細(xì)胞構(gòu)建動物模型,探討F10基因?qū)q癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,F10過表達(dá)組的絨癌細(xì)胞增殖標(biāo)記物表達(dá)增多,凋亡標(biāo)記物表達(dá)減少,而F10沉默組則凋亡標(biāo)記物增多,提示F10基因具有促進(jìn)絨癌細(xì)胞增殖、抗凋亡作用。第三章滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中F10基因干預(yù)后侵襲相關(guān)蛋白酶的表達(dá)目的前述研究證實(shí)經(jīng)F10過表達(dá)和沉默處理后的絨癌細(xì)胞系JEG-3.JAR.BEWO制備裸鼠皮下成瘤動物模型中,F10過表達(dá)組的絨癌細(xì)胞增殖增加,凋亡減少,而F10沉默組的絨癌細(xì)胞凋亡增多,進(jìn)而說明F10基因具有促進(jìn)絨癌細(xì)胞增殖、抗凋亡作用。絨癌的發(fā)生與滋養(yǎng)細(xì)胞的過度侵襲和浸潤密切相關(guān),細(xì)胞的過度增殖是侵襲的前提,細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的破壞是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要原因之一。基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs及其抑制劑的活性與滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲行為存在直接聯(lián)系。由此我們推測F10是否可通過調(diào)節(jié)MMPs及其抑制劑等侵襲相關(guān)因子進(jìn)而影響絨癌細(xì)胞的侵襲行為?本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測各組皮下腫瘤組織中侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)差異,進(jìn)一步探討F10與腫瘤侵襲和浸潤的關(guān)系。方法動物模型構(gòu)建成功后,收集各組腫瘤組織,通過免疫組化法及Western blot檢測以上獲得的動物模型腫瘤組織中MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19.TIMP-1、-3、PAI-1等蛋白表達(dá)差異情況。所有數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、免疫組化法檢測MMP-2、-8、-9.-11、-15、-16、-19、TIMP-1、-3、PAI-1、在JEG-3、JAR, BEWO各組腫瘤組織中的表達(dá)情況1.1免疫組化染色檢測JEG-3及JAR兩種絨癌細(xì)胞皮下成瘤組織,結(jié)果顯示：MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19在F10沉默組、正常對照組、F10過表達(dá)組腫瘤組織中的表達(dá)水平逐漸增高(P0.05)。TIMP-1、-3、PAI-1在F10沉默組、正常對照組、F10過表達(dá)組腫瘤組織中的表達(dá)水平逐漸降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.2 BEWO組腫瘤組織的免疫組化結(jié)果顯示,F10沉默組中的MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19顯著低于正常對照組(P0.05),TIMP-1、-3、PAI-1則顯著高于對照組(P0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2, Western blot檢測MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19、TIMP-1、-3、PAI-1在JEG-3、JAR、BEWO各組腫瘤組織中的表達(dá)情況2.1 JEG-3及JAR兩組腫瘤組織Western blot檢測結(jié)果中,F10過表達(dá)組MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19條帶粗且強(qiáng)度高,半定量結(jié)果顯示,與對照組相比,上述蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05),F10沉默組MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)。 TIMP-1、-3、PAI-1在F10過表達(dá)、對照組、F10沉默組中的表達(dá)強(qiáng)度依次增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.2 Western blot檢測BEWO組腫瘤組織,半定量結(jié)果顯示：與對照組相比,F10沉默組MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19蛋白的表達(dá)下調(diào)(P0.05)；TIMP-1、-3、PAI-1蛋白的表達(dá)上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論在JEG-3、JAR、BEWO三種絨癌細(xì)胞成瘤組織中,F10過表達(dá)組的MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19等促侵襲蛋白顯著增加,TIMP-1、-3、PAI-1等抑制侵襲因子顯著減少,而在F10沉默組結(jié)果剛好相反,這提示F10可通過上調(diào)MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19的表達(dá),下調(diào)TIMP-1、-3、 PAI-1表達(dá),促進(jìn)絨癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。第四章滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中F10基因干預(yù)后信號激酶的活性目的上述研究已證實(shí)經(jīng)F10過表達(dá)和沉默處理后的絨癌細(xì)胞系JEG-3、JAR BEWO制備裸鼠皮下成瘤動物模型中,上游基因F10具有促進(jìn)絨癌細(xì)胞增殖,抑制其凋亡的作用,同時(shí)可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá),下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑及纖溶酶原活化物抑制劑的表達(dá),促進(jìn)絨癌侵襲和浸潤。本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測各組腫瘤組織中相關(guān)信號激酶的活性差異,進(jìn)一步研究F10促進(jìn)絨癌細(xì)胞侵襲和浸潤的具體作用機(jī)制。方法動物模型構(gòu)建成功后,收集各組腫瘤組織,通過免疫組化法及Western blot檢測以上獲得的動物模型腫瘤組織中P-STAT3、P-JNK信號酶蛋白表達(dá)差異情況。所有數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、免疫組化法檢測P-STAT3、P-JNK在JEG-3、JAR、BEWO各組腫瘤組織中的表達(dá)情況1.1免疫組化染色檢測JEG-3、JAR絨癌細(xì)胞皮下成瘤組織,半定量結(jié)果顯示,與正常對照組相比,F10過表達(dá)組及F10沉默組中P-STAT3、P-JNK蛋白激酶表達(dá)均顯著增加(P0.001)。1.2 BEWO組腫瘤組織的免疫組化結(jié)果顯示,在F10沉默組中,P-STAT3、 P-JNK蛋白激酶的表達(dá)水平顯著低于正常對照組。2、Western blot檢測P-STAT3、P-JNK在JEG-3、JAR、BEWO各組腫瘤組織中的表達(dá)情況2.1 JEG-3、JAR絨癌細(xì)胞皮下成瘤組織中Western blot檢測結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致,F10過表達(dá)組及F10沉默組中P-STAT3、P-JNK蛋白激酶表達(dá)水平均高于正常對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。2.2 Western blot檢測BEWO組腫瘤組織,半定量結(jié)果顯示,與正常對照組相比,F10沉默組中P-STAT3、P-JNK蛋白激酶表達(dá)顯著降低(P0.001)。結(jié)論經(jīng)F10過表達(dá)及沉默處理的JEG-3、JAR、BEWO絨癌細(xì)胞制備裸鼠皮下腫瘤,免疫組化及Western blot法檢測P-STAT3及P-JNK的表達(dá)差異,結(jié)果顯示,F10過表達(dá)的P-STAT3、P-JNK在JEG-3、JAR絨癌細(xì)胞系成瘤組織中的表達(dá)顯著上調(diào),而在BEWO細(xì)胞的F10沉默組中顯著下調(diào),提示F10可能通過STAT3及JNK信號通路影響絨癌細(xì)胞的增殖,進(jìn)而參與調(diào)控其侵潤行為。結(jié)合前述研究,提示F10基因不僅可影響絨癌細(xì)胞的增殖和凋亡,并通過改變基質(zhì)金屬蛋白酶等侵入相關(guān)蛋白來促進(jìn)絨癌細(xì)胞侵潤,還可能通過STAT3及JNK信號激酶參與調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲行為。
【關(guān)鍵詞】：滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤 絨癌細(xì)胞系 F10 基質(zhì)金屬蛋白酶 纖溶酶原激活物抑制劑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 摘要3-14
• ABSTRACT14-29
• 前言29-33
• 第一章 滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤動物模型的構(gòu)建33-65
• 1 材料34-39
• 2 方法39-52
• 3 結(jié)果52-63
• 4 討論63-65
• 第二章 F10基因干預(yù)后滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤增殖活性的變化65-83
• 1 材料65-69
• 2 方法69-72
• 3 結(jié)果72-80
• 4 討論80-83
• 第三章 滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中F10基因干預(yù)后侵襲相關(guān)蛋白酶的表達(dá)83-106
• 1 材料84-87
• 2 方法87-91
• 3 結(jié)果91-103
• 4 討論103-106
• 第四章 滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中F10基因干預(yù)后信號激酶的活性106-122
• 1 材料106-110
• 2 方法110-113
• 3 結(jié)果113-119
• 4 討論119-122
• 全文小結(jié)122-123
• 參考文獻(xiàn)123-129
• 縮略詞表129-130
• 成果130-131
• 致謝131-132

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 宋亞麗;張弓;龐戰(zhàn)軍;朱秀蘭;楊曉萍;李雅芳;全松;邢福祺;;F10基因過表達(dá)對A549細(xì)胞致瘤性的影響[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2012年07期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周瑾;葡萄胎發(fā)病相關(guān)基因F10表達(dá)及功能的初步研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2005年

  本文關(guān)鍵詞：新基因F10參與滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤病理機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：371926