本文關鍵詞：低劑量節(jié)拍化療對卵巢癌細胞SKOV3血管生成擬態(tài)的影響及其機制的探討，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)是高侵襲性惡性腫瘤細胞所具有的自我血供的微循環(huán)結構。本實驗通過對荷人卵巢上皮性癌SKOV3細胞裸鼠異種移植瘤模型行不同模式的順鉑(DDP)化療獲取移植瘤原代細胞,比較接受低劑量節(jié)拍化療(low-dose metronomic chemotherapy,LDM)和最大可耐受劑量化療(maximum tolerated dose chemotherapy,MTD)后SKOV3移植瘤原代細胞形成VM的能力、增殖力及侵襲力,同時分析不同化療模式對干細胞標記物CD133、ALDH1蛋白表達的影響,并比較CD133+ALDH1+和CD133-ALDH1-細胞形成血管生成擬態(tài)的差異,以探討不同模式化療對卵巢癌SKOV3細胞形成VM的影響及其可能機制。方法:1建立裸鼠移植瘤模型并分組化療:體外培養(yǎng)SKOV3細胞,將1×107個細胞接種于雌性裸鼠右側的大腿皮下,建立裸鼠異種移植瘤模型。2周后選取30只荷瘤裸鼠隨機分成三組:LDM組給予DDP1mg/kg腹腔注射,每日1次,共18次;MTD組給予DDP3mg/kg腹腔注射,每3日1次,共6次;對照組給與等量生理鹽水腹腔注射,每日1次,共18次。2制備并培養(yǎng)腫瘤原代細胞:化療結束后3-7天分批處死裸鼠,剝出腫瘤經膠原酶消化、研磨、過濾、離心、洗滌,制得單細胞懸液,常規(guī)培養(yǎng)72小時后獲得腫瘤原代細胞。3三維細胞培養(yǎng)(three-dimensional cell culture,3DCC)觀察比較細胞形成VM的能力:將三組原代細胞的單細胞懸液調整密度至5×104個/ml,接種到3DCC模型,利用倒置顯微鏡連續(xù)動態(tài)觀察VM開始形成的時間和最終形成密度,并計數(shù)血管生成擬態(tài)密度(vasculogenic mimicry density,VMD)。實驗重復3次,并拍照記錄。4 MTT實驗檢測三組原代細胞的增殖能力。5利用Transwell小室侵襲實驗檢測三組原代細胞的侵襲力。6采用Westernblot法檢測三組原代細胞中CD133、ALDH1蛋白的表達情況。7流式細胞分選(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)分選細胞:培養(yǎng)MTD組原代細胞至足夠數(shù)量,使用CD133、ALDH1抗體依次標記原代細胞,采用FACS分離獲得兩群細胞:熒光表達較強的細胞群為CD133+ALDH1+細胞,熒光表達較弱的細胞群為CD133-ALDH1-細胞。8 3DCC觀察比較形成VM的差異:將分選得到的CD133+ALDH1+細胞以5×104個/ml的密度,CD133-ALDH1-細胞以5×104個/ml和1×105個/ml的密度,分別接種到3DCC模型培養(yǎng)并觀察比較其形成VM的不同。9統(tǒng)計學方法:實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計,計量資料以均數(shù)±標準差表示;多組間比較采用單因素方差分析,方差齊時多重比較采用S-N-K法;方差不齊時采用Dunnett’s T3法。以α=0.05為檢驗水準,當P0.05時,差異有統(tǒng)計學意義;當P0.05時,差異無統(tǒng)計學意義。結果:1 LDM較MTD模式化療更明顯的抑制SKOV3原代細胞在3DCC模型中VM的形成。3DCC比較三組原代細胞形成VM能力,連續(xù)動態(tài)觀察形成VM情況,記錄最初形成VM的時間:MTD組6小時,對照組9小時,LDM組12小時;接種后48小時形成VM數(shù)量不再變化,計數(shù)VMD:MTD組27.60±9.55個/視野,對照組18.67±4.97個/視野,LDM組11.20±2.59個/視野,三組的VMD差異具有統(tǒng)計學意義(F=24.761;P=0.000)。2 LDM較MTD模式化療可明顯抑制SKOV3原代細胞的增殖能力。MTT檢測不同化療模式對原代細胞增殖的影響。MTT生長曲線表明從第3天開始MTD組高于對照組和LDM組(F=5.738;P=0.018);S-N-K多重比較結果顯示:對照組和LDM組至第5天增殖差異仍無統(tǒng)計學意義(P=0.853)。3 MTD模式化療提升原代細胞侵襲力,LDM模式化療則降低其侵襲力。Transwell小室侵襲實驗結果表明:MTD組細胞穿膜數(shù)為(156.93±22.77),對照組為(112.13±16.59),LDM組為(87.33±19.58),三組間差異均有統(tǒng)計學意義(F=47.570;P=0.000)。4 MTD模式化療可使SKOV3原代細胞中腫瘤干細胞標記物CD133、ALDH1蛋白的表達水平上升。Westernblot檢測結果提示:三組間CD133蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=8.251;P=0.006),S-N-K多重比較結果表明對照組和LDM組之間總體均數(shù)差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.137);三組間ALDH1蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=67.323;P=0.000),對照組和LDM組之間總體均數(shù)差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.517)。5 FCAS結果因Westernblot結果提示MTD組CD133、ALDH1蛋白表達水平較對照組和LDM組顯著升高,故培養(yǎng)MTD組細胞至足夠數(shù)量后進行分選,分選采用CD133抗體和ALDH1抗體的雙重標記。讀取FCAS結果:CD133+ALDH1+所占比例約為1.82%,CD133-ALDH1-所占比例約為79.25%。6低密度的CD133+ALDH1+細胞在6小時即可形成大量VM,而高密度CD133-ALDH1-細胞24小時僅能形成少量VM。將FCAS分選所得細胞以5×104個/ml的密度接種時,CD133+ALDH1+細胞6小時左右形成VM,CD133-ALDH1-細胞48小時仍未形成VM;以1×105個/ml的密度接種CD133-ALDH1-細胞24小時僅形成少量VM。結論:1在累計藥物劑量相同的情況下,經MTD模式化療的SKOV3腫瘤原代細胞比經LDM模式化療的具有更強的VM形成能力、增殖力及侵襲力。2經MTD化療后原代細胞中腫瘤干細胞標記物CD133、ALDH1蛋白的表達水平升高,提示傳統(tǒng)的MTD化療模式可富集具有腫瘤干細胞特性的細胞,這些細胞可能會影響腫瘤的血供并導致其不良預后。相對而言,LDM模式較少富集腫瘤干細胞,可能會較MTD模式化療更為有效和減少復發(fā)。
【關鍵詞】：卵巢上皮性癌 低劑量節(jié)拍化療 最大可耐受劑量化療 血管生成擬態(tài) 三維立體培養(yǎng) 流式細胞分選
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-26
• 結果26-28
• 附圖28-35
• 附表35-37
• 討論37-39
• 結論39-40
• 參考文獻40-42
• 綜述 腫瘤血管生成及抗腫瘤血管生成治療現(xiàn)狀42-51
• 參考文獻46-51
• 致謝51-52
• 個人簡歷52

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本文編號：370626