研究目的：利用三甲曲沙（Trimetrexate,TMQ）誘導(dǎo)建立C57BL/6J小鼠胚胎神經(jīng)管畸形（neuraltube defects,NTDs）動物模型；應(yīng)用全基因組甲基化芯片檢測NTDs胎鼠基因組甲基化水平是否發(fā)生改變；探討相關(guān)基因甲基化水平改變與NTDs產(chǎn)生的關(guān)系。研究方法：將7～8周健康雌性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分組受孕，實(shí)驗(yàn)組利用TMQ于孕7.5（E7.5）天腹腔注射一次，建立神經(jīng)管畸形動物模型，對照組按體重注射生理鹽水。在E11.5天時(shí)，頸椎脫臼處死正常及NTDs孕鼠；經(jīng)HE染色后，光鏡下觀察NTDs發(fā)生及神經(jīng)管閉合情況；測定E7.5天胚胎組織的二氫葉酸還原酶（DHFR）活性；應(yīng)用全基因組甲基化芯片篩選出甲基化的基因，并對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，用RT-PCR對差異基因進(jìn)行表達(dá)分析。研究結(jié)果：1.經(jīng)HE染色電鏡觀察后我們發(fā)現(xiàn)TMQ（8mg/kg）誘導(dǎo)對小鼠的胚胎NTD發(fā)生率最高，胎鼠后腦泡未閉合。TMQ可致使孕鼠子宮明顯腫脹、變形、淤血，可從大體外觀判斷吸收胎、胎鼠發(fā)育遲緩及NTDs的形態(tài)表現(xiàn)。2.與對照組相比，胚胎組織中DHFR活性注射三甲曲沙后在4～8... 

【文章來源】：山西醫(yī)科大學(xué)山西省

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

TMQ引起的各種發(fā)育異常胚胎

常和 NTDs 小鼠胚胎神經(jīng)管 H&E 染色。A 圖是正常和 NTDs 小鼠胚胎端腦的病理結(jié)果；B NTDs 小鼠胚胎后腦的病理結(jié)果。從左至右放大倍數(shù)分別為 20×、50×、200×、400×。論在前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)，通過使用二氫葉酸還原酶抑制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生 NTDs 的型致畸效果穩(wěn)定，但前期研究中二氫葉酸還原酶抑制劑對于小鼠胚胎致畸作用了解清晰，MTX 通過競爭性的抑制二氫葉酸還原酶的活性，可以阻礙了葉酸的模擬出了與人 NTDs 發(fā)病機(jī)制相近的動物模型，而 MTX 誘導(dǎo)產(chǎn)生的 NTDs 與 NTDs 是否有差異仍需驗(yàn)證。本研究在同組研究的基礎(chǔ)上采用二氫葉酸還原酶曲沙進(jìn)行驗(yàn)證，成功的誘導(dǎo)出 NTDs 的小鼠動物模型。二氫葉酸不能被還原成氫葉酸，從而阻礙了葉酸代謝通路，葉酸代謝通路的抑制還影響了一碳單位代謝DNA 和組蛋白的甲基化，影響基因的正常表達(dá)，同時(shí)也干擾了蛋白質(zhì)和脂類的研究指出，DNA 的高甲基化及低甲基化水平都與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的異常有關(guān)，引起穩(wěn)定，這提示我們，是否是因?yàn)榧谆降漠惓?dǎo)致了 DNA 二級結(jié)構(gòu)發(fā)生

圖 1 DNA 質(zhì)檢電泳圖。A 圖為酶切之前的電泳圖。B 圖為對片段化后的 DNA（Input）和免甲基化后的 DNA（IP）凝膠電泳結(jié)果。在甲基化芯片的結(jié)果中會出現(xiàn)以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告。Raw data：這個(gè)結(jié)果包括每個(gè)探針的熒光信號強(qiáng)度的原始值。ratio.gff 文件：包括每個(gè)探針的 log2（MeDIP/Input）。Signalmap 軟件可以導(dǎo)入件直觀的顯示每個(gè)探針的 log2ratio（圖 2 綠線）。ratio_peak_pvalues.gff 文件：Peak 的 P-value 用修正的 KS 檢驗(yàn)算法計(jì)算，它可篩選出的 peak 探針是否比其他區(qū)域的探針 log2ratio 更具有陽性的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P-小，表示這個(gè)探針越有可能代表一個(gè)甲基化事件。此文件可以導(dǎo)入 Signalmap 軟件紅線）。ratio_peak.gff 文件：這個(gè)結(jié)果來自于 ratio_peak_pvalues.gff 文件。NimbleScan據(jù)探針數(shù)=2；-log10P-value 2；peak 長度 500bp，篩選出 peak。Peak 代表可能的甲域。此文件可以導(dǎo)入 Signalmap 軟件（圖 2 藍(lán)線）�；蜃⑨屛募喊ǹ赡艿� peak 的染色體定位信息以及 peak 周圍的基因和 C

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]中國神經(jīng)管畸形高低發(fā)地區(qū)季節(jié)及性別分布特征[J]. 裴麗君,李竹,李松,洪世欣,葉榮偉,陳新,鄭俊池,王太梅,趙秀琴,肖嵐,王麗娜,張伯蘭,劉志欣,周永蘭,姜梅芳,孫霞美,陳海蘭,李敏,楊曉玲,沈泉珍,邵佩云,謝連云.  中華流行病學(xué)雜志. 2003(06)
[2]中國婦女妊娠前后單純服用葉酸對神經(jīng)管畸形的預(yù)防效果[J]. 李竹,RobertJ Berry,李松,J David Erickson,王紅,Cynthia A Moore,趙平,Joseph Mulinare,洪世欣,LeeYangCWong,呼和牧人,Jacqueline Gindler,郝玲,Adolfo Correa,朱慧萍,Elaine Gunter.  中華醫(yī)學(xué)雜志. 2000(07)



本文編號：3541402