目的 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2（enhancer of zeste homolog 2）在維持卵巢癌細(xì)胞干性中起重要作用,且EZH2高表達(dá)與卵巢癌干細(xì)胞順鉑耐藥相關(guān);用PCR芯片篩選發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期檢查點激酶CHEK1（checkpoint kinase 1）可能是EZH2相關(guān)下游基因。本研究旨在探討EZH2是否通過激活CHEK1促進(jìn)卵巢癌干細(xì)胞的順鉑耐藥。方法 1.在SKOV3細(xì)胞株中采用過表達(dá)質(zhì)粒瞬時上調(diào)EZH2的表達(dá)。在前期通過動物皮下瘤化療結(jié)合體外成球建立的SKOV3干細(xì)胞模型SK3rd中,采用慢病毒CRISPR/Cas9系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)EZH2的細(xì)胞株SK3rd-sgEZH2。2.蛋白免疫印跡實驗和qRT-PCR實驗檢測EZH2表達(dá)質(zhì)粒和CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)染后EZH2及CHEK1的表達(dá)變化。3.在SKOV3和A2780中采用過表達(dá)質(zhì)粒瞬時上調(diào)EZH2的表達(dá),或者采用siRNA（Small interfering RNA）干擾技術(shù)瞬時下調(diào)EZ... 

【文章來源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

EZH2促進(jìn)CHEK1的表達(dá)

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文CHEK1 啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性明顯增加，為 5.3 倍，如圖 2A 所示；同樣地，在 A2780細(xì)胞中，與 pGL3 空載體相比上調(diào) EZH2 后 CHEK1 啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性增加了 3.4倍，如圖 2B 所示。反之，與對照組相比，在 SKOV3 細(xì)胞中用兩條 siRNA 序列下調(diào)EZH2，CHEK1 啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性分別下降了 0.3 和 0.26 倍，在 A2780 細(xì)胞中，與對照組相比，下調(diào) EZH2 之后 CHEK1 啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性分別下降了 0.46 倍和 0.39倍，如圖 2A，B 所示。以上結(jié)果表明 EZH2 對 CHEK1 的啟動子區(qū)有轉(zhuǎn)錄激活作用。

圖 3 染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示 EZH2 能直接結(jié)合 CHEK1 的啟動子區(qū)。（A）CHEK1 啟動子區(qū)不同擴(kuò)增片段示意圖。（B）轉(zhuǎn)錄起始位點附近#1 區(qū)和#2 區(qū)的引物序列。（C）在 SKOV3細(xì)胞中，染色質(zhì)免疫共沉淀實驗檢測與 EZH2 抗體結(jié)合的 CHEK1 啟動子區(qū)域的不同片段。以 IgG作為陰性對照。（D）在 A2780 細(xì)胞中，染色質(zhì)免疫共沉淀實驗檢測與 EZH2 抗體結(jié)合的 CHEK1啟動子區(qū)域的不同片段。以 IgG 作為陰性對照。*P<0.05，**P<0.01。三、EZH2 通過 CHEK1 提高卵巢癌細(xì)胞的干性和耐藥性為了進(jìn)一步探討 EZH2 對 CHEK1 的表達(dá)調(diào)控以及是否通過 CHEK1 促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的干性和耐藥性，我們先在卵巢癌細(xì)胞 SK3rd 中下調(diào) EZH2（SK3rd-sgEZH2），檢測 EZH2、CHEK1 及其下游分子的蛋白水平、細(xì)胞周期阻滯、凋亡率和耐藥性的變化；再檢測在 SK3rd-sgEZH2 中同時上調(diào) CHEK1 時（SK3rd-sgEZH2/CHEK1）后，EZH2、CHEK1 及其下游分子的蛋白水平、細(xì)胞周期阻滯、凋亡率和耐藥性的變化。3.1 EZH2 通過 CHEK1 促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的干性


本文編號：3446142