目的利用RNA干擾技術(shù)建立穩(wěn)定敲低OPTN蛋白的人SKOV3細(xì)胞株和利用CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)建立穩(wěn)定敲除OPTN蛋白的人SKOV3細(xì)胞株,并研究降低OPTN基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞抗癌藥物敏感性的影響。方法針對(duì)OPTN基因設(shè)計(jì)shRNA和sgRNA的序列,并與慢病毒載體質(zhì)粒pGPU 6_GFP_Neo和敲除質(zhì)粒PX 459載體連接產(chǎn)生重組載體。并將重組的質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證,將測(cè)序成功的重組質(zhì)粒載體與包裝質(zhì)粒（psPAX 2、pMD 2.G）共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝,收集病毒上清液并感染SKOV3細(xì)胞,獲得穩(wěn)定敲低和穩(wěn)定敲除OPTN基因的SKOV3細(xì)胞株。RT-PCR檢測(cè)敲低組OPTN基因的表達(dá)的變化,PCR檢測(cè)敲除組的基因組DNA的變化,Western blot法分析檢測(cè)OPTN蛋白的表達(dá)情況。MTT法檢測(cè)DDP對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響,qRT-PCR檢測(cè)caspase3、Bax、Bcl-2的mRNA的表達(dá)情況,Western blot檢測(cè)caspase3、Bax、和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果成功構(gòu)建慢病毒載體和基因敲除載體,在SKOV... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,55(09)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果

將經(jīng)篩選后的敲除組SKOV3細(xì)胞利用天根生化科技公司的細(xì)胞基因組DNA的提取試劑盒,按照其說明書提取SKOV3細(xì)胞的基因組DNA,根據(jù)設(shè)計(jì)的引物序列進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示與WT組相比KO組沒有P出條帶,說明在靶點(diǎn)附近的DNA片段被敲除。見圖3。圖3 敲除OPTN在基因組DNA水平上的鑒定

敲除OPTN在基因組DNA水平上的鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]p62、OPTN在宮頸癌中的表達(dá)及其與HPV的相關(guān)性[J]. 翟淑娟,潘景,孫春意,劉洋,楊瑩瑩,周紅林.  昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2019(04)
[2]敲減EEF1D的人卵巢癌細(xì)胞的構(gòu)建及其藥物敏感性研究[J]. 汪慎燚,徐恰,阮昕,席浩,王鵬,陳曦,秦宜德.  安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(06)
[3]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建ATF4基因敲除的HepG2細(xì)胞株[J]. 易橋勇,王秋雁,李天宇.  廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(05)
[4]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建GLRX3基因敲除的HEK293細(xì)胞系[J]. 代鑫,趙俊麗,楊沛艷,夏海濱.  陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2017(01)
[5]RNA干擾ERCC1基因表達(dá)對(duì)人卵巢癌耐藥細(xì)胞DDP、PGPIPN敏感性的影響[J]. 雷婷,秦宜德,劉琛,周娟,趙夢(mèng)靜.  安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2015(06)



本文編號(hào)：3389584