目的利用RNA干擾技術(shù)建立穩(wěn)定敲低OPTN蛋白的人SKOV3細(xì)胞株和利用CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)建立穩(wěn)定敲除OPTN蛋白的人SKOV3細(xì)胞株,并研究降低OPTN基因表達(dá)對細(xì)胞抗癌藥物敏感性的影響。方法針對OPTN基因設(shè)計shRNA和sgRNA的序列,并與慢病毒載體質(zhì)粒pGPU 6_GFP_Neo和敲除質(zhì)粒PX 459載體連接產(chǎn)生重組載體。并將重組的質(zhì)粒測序驗證,將測序成功的重組質(zhì)粒載體與包裝質(zhì)粒（psPAX 2、pMD 2.G）共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝,收集病毒上清液并感染SKOV3細(xì)胞,獲得穩(wěn)定敲低和穩(wěn)定敲除OPTN基因的SKOV3細(xì)胞株。RT-PCR檢測敲低組OPTN基因的表達(dá)的變化,PCR檢測敲除組的基因組DNA的變化,Western blot法分析檢測OPTN蛋白的表達(dá)情況。MTT法檢測DDP對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響,qRT-PCR檢測caspase3、Bax、Bcl-2的mRNA的表達(dá)情況,Western blot檢測caspase3、Bax、和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果成功構(gòu)建慢病毒載體和基因敲除載體,在SKOV... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2020,55(09)北大核心

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【部分圖文】：

重組質(zhì)粒的測序結(jié)果

將經(jīng)篩選后的敲除組SKOV3細(xì)胞利用天根生化科技公司的細(xì)胞基因組DNA的提取試劑盒,按照其說明書提取SKOV3細(xì)胞的基因組DNA,根據(jù)設(shè)計的引物序列進(jìn)行PCR驗證。結(jié)果顯示與WT組相比KO組沒有P出條帶,說明在靶點附近的DNA片段被敲除。見圖3。圖3 敲除OPTN在基因組DNA水平上的鑒定

敲除OPTN在基因組DNA水平上的鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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