本文關鍵詞：陰道假絲酵母菌病及復發(fā)性陰道假絲酵母菌病患者陰道菌群結構的對比分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是一種常見外陰陰道炎癥。VVC大約占有癥狀感染者的17%-39%,約占微生物所致陰道炎的25%-30%；其中5%-8%的VVC患者發(fā)展為復發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC),即一年內VVC發(fā)作4次或以上。外陰陰道假絲酵母菌病的致病菌以白假絲酵母菌(Candida albicans,C.albicans)為主,約占60%,其他非白色假絲酵母菌也占相當比例。假絲酵母菌寄居于陰道粘膜,它與乳酸桿菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌等定植菌構成陰道正常菌群,菌群之間存在共生及拮抗的關系,共同形成一個動態(tài)的平衡。細菌叢能抵抗假絲酵母菌的生長,陰道粘膜預防真菌侵入,陰道內寄生的厭氧菌和乳酸菌對陰道上皮細胞有保護作用。正常情況下,定植的假絲酵母菌不會引起任何不適,但當女性生殖道內的微生態(tài)菌群受到環(huán)境變化、藥物刺激、宿主的激素水平和免疫狀態(tài)低下等因素的影響,平衡狀態(tài)被打破,優(yōu)勢繁殖的假絲酵母菌引起假絲酵母菌性陰道病。陰道內的微生態(tài)平衡狀態(tài)改變,是VVC發(fā)生的重要原因之一。而假絲酵母菌是一種二態(tài)共棲真菌,容易受外界環(huán)境影響而發(fā)生變異,故陰道真菌菌群具有高度多樣性,其結構的改變與RVVC發(fā)生發(fā)展有相互關系。早期研究主要集中在假絲酵母菌的菌種培養(yǎng)及藥敏情況,較少分析陰道微生態(tài)菌群的整體構成與其在疾病的發(fā)生發(fā)展和轉歸中的變化情況。因此,了解VVC及RVVC患者的陰道微生態(tài)菌群結構及動態(tài)變化,有利于我們了解生殖道假絲酵母病的發(fā)生、發(fā)展過程,進一步指導臨床治療及預防復發(fā)。陰道菌群主要為厭氧菌,使用傳統(tǒng)培養(yǎng)和分離鑒定的方法難以全面認識多樣性的陰道菌群構成。隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展,非培養(yǎng)依賴性技術逐漸成熟,研究者可以利用16S rRNA基因聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增這種陰道微生物的非培養(yǎng)法,通過Illumina Solexa高通量測序平臺測序、結合帶標簽的基于熒光測序平臺的雙末端測序(Barcoded Paired-End Illumina Sequencing, BIPES),可快速、全面了解陰道微生物群落結構信息。目前已有相關報道闡明了健康受試者和假絲酵母菌病患者陰道微生物群落菌群組成及其多樣性變化。然而,對假絲酵母菌病患者積極治療前后其陰道微生物群落菌群的整體結構、組成及變化,至今仍然沒有深入的研究。欲從病因上達到假絲酵母菌病治愈的目的,這仍需通過全面了解疾病狀態(tài)下女性生殖道菌群結構及多樣性變化,對臨床治療與陰道微生態(tài)變化的相關性進一步深入研究。研究目的1、通過Illumina高通量測序技術及BIPES的序列研究方法,了解WC和RVVC患者治療前后陰道微生物菌群的結構,分析陰道菌群的多樣性改變,了解治療藥物對WC和RVVC患者陰道菌群改變的差異,探討菌群的改變與治療效果的相關性。2、追蹤觀察VVC和RVVC患者在第二觀察月經(jīng)周期中(為非發(fā)病周期)與原治療前后相對應月經(jīng)周期日的陰道菌群結構信息,了解月經(jīng)周期、疾病因素與患者陰道菌群的相關性,探討假絲酵母菌病的發(fā)生、康復與菌群結構改變的相關性。方法1.實驗對象：實驗一：2013年4月-2013年12月就診于佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院婦科門診的患者6例,平均年齡(30.16±6.66)歲�；颊呔炇鹬橥鈺�。VVC組(3例)納入標準：①癥狀：外陰瘙癢、灼痛,可伴有性交痛、尿痛、陰道分泌物增多等；②體征：外陰潮紅、水腫,可伴抓痕或皸裂,小陰唇內側及陰道粘膜潮紅,附著白色膜狀物；陰道內可見白色粘稠呈乳膠或豆渣樣分泌物；③實驗室檢查：濕涂片(以生理鹽水和10%KOH制備)證實存在假絲酵母菌的芽生孢子或假菌絲；或真菌培養(yǎng)培養(yǎng)有白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌等生長。RVVC組(3例)納入標準：①符合VVC診斷標準,并在一年內有癥狀并經(jīng)真菌學證實的VVC發(fā)作4次或以上。②實驗室檢查：濕涂片(以生理鹽水和10%KOH制備)證實存在假絲酵母菌的芽生孢子或假菌絲；或真菌培養(yǎng)培養(yǎng)有白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌等生長。兩組患者確診后予鹽酸特比萘芬陰道泡騰片治療(陰道內用藥,50 mg/d,共7d),治療結束后,患者均自覺外陰瘙癢癥狀緩解、白帶減少,實驗室濕涂片檢查真菌陰性。實驗二：實驗一中所選取的6例觀察對象,分別納入WCⅡ組、RVVCⅡ組,以非發(fā)病期所在月經(jīng)周期為第二觀察周期。納入標準同實驗一�；颊呔炇鹬橥鈺Ｅ懦龢藴剩貉芯繉ο笤陆�(jīng)規(guī)則,為非妊娠期、哺乳期；排除全身系統(tǒng)性疾病如：糖尿病、激素治療性疾病(如急慢性腎炎)等；排除其他陰道炎如：滴蟲性、細菌性陰道病等；1個月內無全身應用抗生素、免疫抑制劑、陰道用藥史,3天內無性生活史及陰道灌洗。2.標本采集實驗一研究對象于發(fā)病期用藥前及用藥第8天取材,而實驗二研究對象于非發(fā)病期中與藥物治療前后相對應的月經(jīng)周期日取材。用無菌陰道拭子于陰道穹窿處陰道壁取分泌物。將陰道拭子置于無菌干燥試管中,用于提取細菌總DNA。標本采集后放于4℃標本箱保存送檢。3.細菌總DNA的提取與檢測 以細菌基因組DNA提取試劑盒提取樣本中總DNA,具體操作步驟參照說明書。提取的總DNA經(jīng)紫外分光光度計(波長為570)測定純度和濃度,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后放置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.16s rRNA V4區(qū)基因片段的擴增及Illumina測序以樣本總DNA為模版,采用引物(上海生工生物工程股份有限公司)514F和805R,擴增其中的16s rRNAV4區(qū)基因。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)量和特性,經(jīng)回收純化后,通過Illumina Hiseq2000平臺進行雙末端100 bp測序(華大基因,深圳)。5.生物信息學分析所測得的序列經(jīng)過BIPES操作進行初步處理,保留有效測序數(shù)據(jù)進行修剪；反向互補組裝V4序列；使用兩階段聚類(Twostage-cluste ring, TSC)進行聚類,提取出每個操作分類單元(operational taxonomy units, OTU)的代表序列后利用全局比對序列分類(Global alignment -for sequence taxonomy, GAST)進行物種的分類,其中屬于乳酸菌屬的OTU利用Blast進一步分到種級別,基于進化關系分析細菌群落結構距離(Unifrac Distance),采用微生物生態(tài)學定量研究(Quantitative Insights Into Microbial Ecology, QIIME)進行陰道菌群主成分分析。6.統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料采用率(%)或構成比表示,組間比較采用x2檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,組內或組間比較采用方差分析；P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果實驗一：1.測序數(shù)據(jù)采用BIPES流程進行分析,采用UCHIME去除嵌合體序列,本實驗測序樣品數(shù)12個,共獲得928028條序列,平均每個樣品77340條。2.應用全聯(lián)聚類(Complete linkage)的方法對VVC組和RVVC組的陰道菌群進行聚類分析。VVC組和RVVC組陰道微生態(tài)優(yōu)勢菌群多樣性未能以疾病分組顯著區(qū)分,而是以個體菌群為特征聚類。VVC組用藥后菌群較用藥前差異明顯,而RVVC組用藥后菌群與用藥前菌群結構更相似。說明菌群以個體為單位聚類,用藥前后的樣品菌群相似度大于疾病的影響。3.應用歐式距離(Euclidean distance)展示VVC組和RVVC組陰道菌群用藥前后的差異。VVC組用藥后的菌群變化幅度較大,RVVC組用藥后菌群差異較小或不變,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.在屬水平分析VVC組和RVVC組用藥前后菌屬構成比的差異。顯示VVC組用藥前雙歧桿菌、惰性乳桿菌、加德納菌比例較高,分別占各自標本的80%、55%、45%,用藥后菌群中原優(yōu)勢菌的比例降低約15%～55%,乳酸菌豐度增加成為優(yōu)勢菌,個體治療前后的差異存在統(tǒng)計學意義(P0.05)。而藥物治療后RVVC組菌屬構成比基本一致,個體治療前后的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.以OTU的個數(shù)測定(Observed-species)(a)、趙氏菌種豐富度指數(shù)(Chaol)(b)、譜系多樣性(PD-whole-tree)(c)和香農(nóng)指數(shù)(Shannon Index)(d)四個指標分析,展示VVC組和RVVC組用藥后陰道菌群的a-多樣性未發(fā)生顯著變化。(p均0.05)。6.通過LEfSe統(tǒng)計兩組菌屬差異表明,未發(fā)現(xiàn)VVC組和RVVC兩組用藥前后存在差異性菌屬。實驗二：1.測序數(shù)據(jù)采用BIPES流程進行分析,采用UCHIME去除嵌合體序列,本實驗測序樣品數(shù)12個,共獲得929032條序列,平均每個樣品77420條。2.應用全聯(lián)聚類(Complete linkage)的方法對VVCⅡ組和RVVCⅡ組的陰道菌群進行聚類分析。VVCⅡ組和RVVCⅡ組陰道微生態(tài)優(yōu)勢菌群多樣性仍以個體菌群為特征聚類,VVCⅡ組菌群存在多樣性變化,RVVCⅡ組菌群結構無顯著變化。兩組陰道微生態(tài)優(yōu)勢菌群的差異不顯著(P=0.465)。3.在屬水平分析VVCⅡ組和RVVCⅡ組菌屬構成比的差異。每例患者分別采集了用藥前同期(第一個圖柱)和用藥后同期(第二個圖柱)的樣品,分析了VVCⅡ組和RVVCⅡ組在非發(fā)病觀察期用藥前后同期的陰道菌群菌屬,從屬水平對兩組菌屬構成比差異進行分析。VVCⅡ組和RVVCⅡ組個體用藥前后同期的差異不顯著,說明非發(fā)病期VVC患者及RWC患者的優(yōu)勢菌群相似,陰道內微生態(tài)處于相似穩(wěn)定狀態(tài)。4.在屬水平分別分析VVC組和VVC Ⅱ組、RVVC組和RVVCⅡ組菌屬構成比的差異。每例患者分別采集了用藥前(第一個圖柱)、用藥后(第二個圖柱)、用藥前同期(第三個圖柱)和用藥后同期(第四個圖柱)的樣品,分析了VVC組、RWC組患者在發(fā)病期和非發(fā)病期同期的陰道菌群菌屬,分別對兩組菌屬構成比差異進行分析。VVC Ⅱ組與VVC組優(yōu)勢菌群差異存在顯著變化(P=0.012),而RWCⅡ組與RVVC組菌群差異仍較相似(P=0.541)。說明假絲酵母菌病的偶然發(fā)生可以干擾陰道菌群的平衡；當反復發(fā)作時,假絲酵母菌病與陰道微生物群落優(yōu)勢菌之間的相關性則明顯減弱。結論1.抗菌藥物殺滅假絲酵母菌屬菌同時,降低了假絲酵母菌對乳桿菌的拮抗作用,從而調整了陰道菌群的結構,使菌群結構逐漸趨向于正常�？拐婢幬镏委煵⒎谴偈够颊叱霈F(xiàn)新的菌屬,而是調節(jié)陰道菌群自身內部的構成,恢復菌群平衡狀態(tài)達到治療效果。2.VVC組和RVVC組陰道微生態(tài)優(yōu)勢菌群多樣性是以個體菌群為特征聚類。VVC組對藥物治療較敏感,而對RVVC患者的治療并未引起陰道微生態(tài)的明顯變化。兩組非發(fā)病期患者的陰道微生物優(yōu)勢菌群與發(fā)病期比較,VVC組有顯著差異,而RVVC組無明顯差異,說明假絲酵母菌病的偶然發(fā)生可以干擾陰道菌群的平衡；當反復發(fā)作時,假絲酵母菌病與陰道微生物群落優(yōu)勢菌之間的相關性則明顯減弱。
【關鍵詞】：外陰陰道假絲酵母菌病 菌群結構 16S rRNA
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R711.3
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-24
• 第一章 WC與RWC患者陰道菌群結構的比較24-39
• 1.1 實驗材料24-27
• 1.2 實驗方法27-30
• 1.3 實驗結果30-35
• 1.4 討論35-38
• 1.5 小結38-39
• 第二章 WC與RVVC患者非發(fā)病周期中的菌群結構比較39-56
• 2.1 實驗材料39-42
• 2.2 實驗方法42-44
• 2.3 實驗結果44-51
• 2.4 討論51-55
• 2.5 小結55-56
• 全文總結56-57
• 參考文獻57-62
• 綜述62-77
• 參考文獻72-77
• 附錄77-79
• 攻讀學位期間成果79-80
• 致謝80-82

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郭莉娜;徐英春;謝秀麗;;假絲酵母菌屬耐藥的分子機制研究新進展[J];中華醫(yī)院感染學雜志;2009年18期

  本文關鍵詞：陰道假絲酵母菌病及復發(fā)性陰道假絲酵母菌病患者陰道菌群結構的對比分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：337908