本文關(guān)鍵詞：同源異形框基因PRX-2調(diào)控人表皮干細(xì)胞增殖的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 孕中期胎兒的皮膚創(chuàng)傷后以再生方式進(jìn)行修復(fù),而成人皮膚創(chuàng)面以瘢痕方式愈合。既往研究發(fā)現(xiàn),同源異形框基因PRX-2在胎兒和成人皮膚及創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)存在顯著差異。表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells, ESCs)與正常皮膚更新生長(zhǎng)和創(chuàng)面修復(fù)密切相關(guān),在胎兒時(shí)期的ESCs主要分布在真皮乳頭層,成人主要位于表皮基底層和毛囊隆突部,上述胎兒或成人皮膚ESCs主要分布的區(qū)域正是PRX-2基因陽(yáng)性表達(dá)的位置�；谝陨涎芯窟M(jìn)展,可以推測(cè)PRX-2和ESCs之間以及與胎兒和成人皮膚創(chuàng)傷修復(fù)方式的不同存在某種關(guān)系。因此,本研究使用慢病毒載體介導(dǎo)的PRX-2基因過(guò)表達(dá)成人ESCs和慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA沉默胎兒ESCs的PRX-2基因,改變胎兒ESCs和成人ESCs中PRX-2基因的表達(dá),觀察其細(xì)胞增殖的變化情況,從正、反兩個(gè)方向研究PRX-2基因在人ESCs增殖中的作用,為從發(fā)育生物學(xué)角度進(jìn)行創(chuàng)面再生修復(fù)機(jī)制的研究提供理論和方法學(xué)基礎(chǔ)。方法1.采集水囊引產(chǎn)的健康孕20～28周齡胎兒背部的全層皮膚,成人皮膚主要來(lái)自在本院泌尿外科24小時(shí)內(nèi)行包皮環(huán)切術(shù)的患者。Dispase酶分離表皮和真皮,胰酶消化法得到表皮細(xì)胞懸液,Ⅳ型膠原粘附法獲得人ESCs,倒置相差顯微鏡下觀察人表皮干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,免疫熒光染色法/流式鑒定細(xì)胞的表面標(biāo)志物β1整合素、K19、P63、K7和K10。2.CCK-8法檢測(cè)胎兒ESCs和成人ESCs的增殖活性,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中PRX-2基因的表達(dá)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2代胎兒ESCs和成人ESCs,使用慢病毒載體介導(dǎo)的PRX-2基因過(guò)表達(dá)成人ESCs和慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA沉默胎兒ESCs中的PRX-2基因。轉(zhuǎn)染3-4天后,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)情況,接著應(yīng)用Western blot;法檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染情況。確認(rèn)導(dǎo)入目標(biāo)基因后,采用CCK-8法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,檢測(cè)胎兒ESCs和成人ESCs的增殖情況,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。結(jié)果1.采用Ⅳ型膠原黏附法獲得胎兒ESCs和成人ESCs,并進(jìn)行體外培養(yǎng),獲得的兩種細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)ESCs的表面標(biāo)志物。胎兒ESCs和成人ESCs的體積均較小,近乎圓形,但胎兒ESCs的體積較成人ESCs的體積更小,二者均呈典型的“鋪路石樣”和克隆性生長(zhǎng)。透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)胎兒ESCs和成人ESCs的細(xì)胞核均較大,核仁較明顯,胞漿較少。綜合以上結(jié)果確定分離得到的細(xì)胞是ESCs。2.胎兒ESCs的增殖速率顯著快于成人ESCs,并且胎兒ESCs中PRX-2基因的表達(dá)高于成人ESCs;病毒轉(zhuǎn)染后的ESCs在熒光顯微鏡下可觀察到GFP的表達(dá);Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,PRX-2基因過(guò)表達(dá)成人ESCs組的PRX-2蛋白表達(dá)上調(diào),PRX-2基因沉默胎兒ESCs組的PRX-2蛋白表達(dá)下調(diào)。生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示,與成人ESCs寸照組相比,PRX-2基因過(guò)表達(dá)成人ESCs組的增殖速度顯著增加;PRX-2基因沉默的胎兒ESCs組與胎兒ESCs對(duì)照組相比,其增殖速度顯著降低。細(xì)胞周期結(jié)果表明,PRX-2基因過(guò)表達(dá)的成人ESCs組中處于增殖周期(S期)的細(xì)胞比例顯著高于成人ESCs對(duì)照組;PRX-2基因沉默的胎兒ESCs組中處于增殖周期(S期)的細(xì)胞比例顯著低于胎兒ESCs對(duì)照組。結(jié)論胎兒ESCs中PRX-2基因的表達(dá)高于成人ESCs,過(guò)表達(dá)PRX-2基因后ESCs的增殖能力顯著增強(qiáng)。同源異型框基因PRX-2在皮膚再生愈合方面發(fā)揮重要作用。
【關(guān)鍵詞】：胎兒 人表皮干細(xì)胞 增殖 PRX-2 基因轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R714.5
【目錄】：

• 縮略詞表6-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一部分 胎兒和成人表皮干細(xì)胞的分離、提取和鑒定12-25
• 前言12-13
• 材料與方法13-17
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果17-21
• 討論21-22
• 小結(jié)22-23
• 參考文獻(xiàn)23-25
• 第二部分 PRX-2對(duì)人表皮干細(xì)胞增殖影響的研究25-40
• 前言25
• 材料與方法25-31
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-36
• 討論36-37
• 小結(jié)37-38
• 參考文獻(xiàn)38-40
• 文獻(xiàn)綜述40-50
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章50-51
• 致謝51-52

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：同源異形框基因PRX-2調(diào)控人表皮干細(xì)胞增殖的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：322438