本文關(guān)鍵詞：miR-99b-5p靶向mTOR誘導子宮內(nèi)膜癌細胞自噬，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:EEC進程中自噬逐漸減弱,其機制和病理生理意義均不清楚,而自噬是第二大程序化細胞死亡方式,m TOR是自噬的核心調(diào)控器,m TOR在EEC進程中活性增強。has-mi R-99b-5p是已經(jīng)被生物信息學和實驗證實的強靶向m TOR的mi Rs,其在子宮內(nèi)膜癌的進程中表達水平與子宮內(nèi)膜癌自噬情況同步,也是逐漸減弱,故該mi R存在通過m TOR調(diào)控EEC自噬的可能,并誘導EEC自噬性死亡。本研究主要目的是證實mi R-99b-5p可以靶向作用于m TOR誘導ishikawa細胞自噬,分析其調(diào)控自噬的時間和劑量效應(yīng),為后續(xù)研究促使子宮內(nèi)膜癌細胞自噬性死亡的機制和調(diào)控自噬為子宮內(nèi)膜癌治療提供新的理論依據(jù)。方法:首先進行mi R99b-5p與m TOR靶向結(jié)合的生物信息學分析,進行子宮內(nèi)膜癌細胞的培養(yǎng),然后分析mi R99b-5p在不同濃度和不同時間下誘導子宮內(nèi)膜癌細胞自噬相關(guān)蛋白的m RNA及其蛋白水平變化的情況。設(shè)置相同濃度mi R99b-5p進行不同時間的轉(zhuǎn)染并觀察作用于子宮內(nèi)膜癌細胞,再次行蛋白印跡法檢測自噬標志蛋白LC3和beclin1的表達情況,RT-PCR檢測自噬基因beclin1的m RNA的表達水平。第三,設(shè)置對照組觀察添加特異性自噬誘導劑雷帕霉素、自噬特異性抑制劑3MA和CQ與mi R99b-5p共同孵育后,觀察細胞形態(tài)學LC3細胞免疫熒光和MDC自噬泡染色方法檢測自噬標志物的表達情況,系統(tǒng)地分析mi R99b-5p誘導子宮內(nèi)膜癌細胞自噬的發(fā)生。Western blot檢測信號通路關(guān)鍵蛋白m TOR,LC3表達。細胞免疫熒光檢測自噬蛋白MAP1-LC3表達量,MDC染色法檢測自噬泡的數(shù)量。用SPSS 13.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析并作圖。結(jié)果:生物信息學分析結(jié)果表明,mi R-99b-5p以m TOR為靶基因,且具有保守性。mi R-99b-5p劑量和時間依賴性地誘導ishikawa細胞自噬,以80nm和作用時間為6h時,mi R-99b-5p對ishikawa細胞自噬的誘導作用最為明顯,其增加LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比率,促進beclin-1蛋白和m RNA的表達,細胞內(nèi)的自噬泡和自噬小體數(shù)量均明顯增加了,分別用3MA和CQ抑制自噬過程后,則mi R-99b-5p對ishikawa細胞自噬的誘導作用均減弱。結(jié)論:mi R-99b-5p靶向結(jié)合自噬調(diào)控關(guān)鍵蛋白m TOR;mi R99b-5p在濃度和時間依賴性上調(diào)LC3和beclin1表達;抑制自噬減低mi R-99b-5p對ishikawa細胞凋亡的誘導作用。
【關(guān)鍵詞】：自噬 凋亡 ishikawa細胞
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 縮略語10-11
• 前言11-16
• 1 材料與方法16-22
• 1.1 實驗材料16-17
• 1.2 實驗方法17-22
• 2 結(jié)果22-34
• 2.1 miR-99b-5p對mTOR靶基因生物信息學分析22-26
• 2.2 miR-199a-3p濃度和時間依賴性上調(diào)LC3和beclin1表達26-31
• 2.3 抑制自噬過程減低miR-99b-5p對ishikawa細胞自噬的誘導作用31-34
• 3 討論34-38
• 4 結(jié)論38-39
• 參考文獻39-43
• 文獻綜述43-51
• 參考文獻48-51
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文51-52
• 致謝52

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本文編號：300661