目的建立用于人乳頭瘤病毒HPV16及HPV18快速檢測的實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。方法運(yùn)用在線LAMP引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V5,針對HPV16、18基因保守序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,在反應(yīng)前加入核酸染料SYBR GreenⅠ并對LAMP反應(yīng)體系中內(nèi)引物、Mg²⁺、dNTPs進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化結(jié)果通過實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線確定;然后對優(yōu)化的HPV16、18 LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行特異性、靈敏度檢測及臨床標(biāo)本檢測。結(jié)果建立的實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系檢測HPV16及HPV18的特異性為100%,與qPCR方法的符合率為100%。該體系檢測HPV16及HPV18質(zhì)粒的靈敏度為10拷貝/μl。結(jié)論建立的實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系檢測HPV16、18簡便、快速,靈敏度高,可用于HPV感染的早期篩查。 

【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2020,15(01)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

Mg2+濃度的優(yōu)化結(jié)果

LAMP反應(yīng)體系包括3種引物:內(nèi)引物(FIP,BIP)、外引物(F3,B3)、環(huán)引物(LF,LB)。在Bst DNA聚合酶的作用下,內(nèi)引物的延伸產(chǎn)物被置換,形成"啞鈴"狀結(jié)構(gòu),在環(huán)引物的引導(dǎo)下,擴(kuò)增反應(yīng)得以加速;在LAMP反應(yīng)中,內(nèi)引物要自身彎折互補(bǔ)形成莖環(huán),所以需要較長的堿基序列。當(dāng)內(nèi)引物濃度過時(shí),反而會造成引物間二級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。本試驗(yàn)分別選取0.8、1.2、1.6、2 μmol/L的內(nèi)引物濃度進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果見圖3。當(dāng)濃度比從0.8 μmol/L～1.2 μmol/L變化時(shí),熒光曲線逐漸出現(xiàn)擴(kuò)增表現(xiàn),并且隨著濃度比例的增加起峰時(shí)間(Ct)越來越早;當(dāng)濃度比為2 μmol/L時(shí),雖然峰值增加,但是起峰時(shí)間(Ct)較晚。因此確定內(nèi)引物(FIP,BIP)的最佳濃度比為1.6 μmol/L。圖3 內(nèi)引物濃度比例優(yōu)化

內(nèi)引物濃度比例優(yōu)化

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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