目的:通過構建敲減、敲除、過表達OPTN基因的SKOV3和Hela細胞系,研究OPTN基因表達影響SKOV3和Hela細胞對抗癌藥物DDP的敏感性。方法:針對人OPTN基因序列設計sh RNA（敲減）、sg RNA（敲除）、LV-OPTN（過表達）的序列,構建慢病毒表達載體,轉染293T細胞獲得慢病毒上清,并感染SKOV3、Hela細胞,經過篩選獲得穩(wěn)定的敲低、敲除、過表達的SKOV3、Hela細胞系。PCR檢測敲除OPTN基因,RT-PCR檢測敲減、過表達前后OPTN基因表達量的變化;Western blot檢測敲低、敲除、過表達OPTN基因的SKOV3和Hela細胞OPTN蛋白表達的變化;MTT法檢測DDP對敲低、敲除、過表達OPTN的SKOV3、Hela細胞增殖的影響;流式細胞儀檢測OPTN的表達對SKOV3、Hela細胞凋亡的影響;q RT-PCR和Western blot檢測凋亡相關基因caspase3、Bax、Bcl-2、PI3K、AKT、m TOR、MDR1、ERCC1、BRCA1的基因表達量（m RNA和蛋白質）的變化,探討其對PI3K-AKT-m TOR信號通路、凋亡... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學安徽省

【文章頁數】：65 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

質粒的酶切Fig1.Plasmiddigestion

安徽醫(yī)科大學碩士學位論文22獲得過表達重組質粒PEGFP-NI后，由于插入的為OPTN的編碼區(qū)的mRNA片段大小為1743bp因此可以利用雙酶切的方法進行鑒別，經NheI和XhoI酶切后出現4.7kb和1743bp兩個片段，則證明過表達重組質粒構建成功,見圖2A。獲得敲除重組質粒PX459后，在目的基因片段序列上設計PCR引物，成功重組的質�？梢詳U出大小約為500bp的片段，未成功構建的質粒則擴不出片段,見圖2B。獲得敲減重組質粒PLVX后，由于在質粒PLVX兩個酶切位點EcoRI和BamHI之間只有11bp,而插入的目的片段為60bp左右，因此設計了跨酶切位點的PCR引物，成功重組的質粒大小約為220bp,而空載質粒則出現170bp大小的片段，說明PLVX-OPTN構建成功，見圖2C。圖2重組質粒的初步鑒定Fig2.PreliminaryidentificationofrecombinantplasmidsA:過表達質粒雙酶切驗證（1：過表達）；B：敲除質粒PCR驗證（1、3：對照；2、4：敲除）；C:敲減質粒PCR驗證(1：敲減；2：對照)；M:Marker3.1.3重組質粒的測序驗證將初步鑒定成功的重組質粒送至上海生工生物有限公司進行基因測序，從圖譜結果看出，片段插入的位置正確，和實驗設計的堿基序列相同，說明重組質粒構建成功，重組質粒的圖譜見圖3。

重組質粒測序圖譜

【參考文獻】：
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本文編號：2980700