目的:通過(guò)構(gòu)建敲減、敲除、過(guò)表達(dá)OPTN基因的SKOV3和Hela細(xì)胞系,研究OPTN基因表達(dá)影響SKOV3和Hela細(xì)胞對(duì)抗癌藥物DDP的敏感性。方法:針對(duì)人OPTN基因序列設(shè)計(jì)sh RNA（敲減）、sg RNA（敲除）、LV-OPTN（過(guò)表達(dá)）的序列,構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得慢病毒上清,并感染SKOV3、Hela細(xì)胞,經(jīng)過(guò)篩選獲得穩(wěn)定的敲低、敲除、過(guò)表達(dá)的SKOV3、Hela細(xì)胞系。PCR檢測(cè)敲除OPTN基因,RT-PCR檢測(cè)敲減、過(guò)表達(dá)前后OPTN基因表達(dá)量的變化;Western blot檢測(cè)敲低、敲除、過(guò)表達(dá)OPTN基因的SKOV3和Hela細(xì)胞OPTN蛋白表達(dá)的變化;MTT法檢測(cè)DDP對(duì)敲低、敲除、過(guò)表達(dá)OPTN的SKOV3、Hela細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)OPTN的表達(dá)對(duì)SKOV3、Hela細(xì)胞凋亡的影響;q RT-PCR和Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)基因caspase3、Bax、Bcl-2、PI3K、AKT、m TOR、MDR1、ERCC1、BRCA1的基因表達(dá)量（m RNA和蛋白質(zhì)）的變化,探討其對(duì)PI3K-AKT-m TOR信號(hào)通路、凋亡... 

【文章來(lái)源】：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

質(zhì)粒的酶切Fig1.Plasmiddigestion

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文22獲得過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒PEGFP-NI后，由于插入的為OPTN的編碼區(qū)的mRNA片段大小為1743bp因此可以利用雙酶切的方法進(jìn)行鑒別，經(jīng)NheI和XhoI酶切后出現(xiàn)4.7kb和1743bp兩個(gè)片段，則證明過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,見圖2A。獲得敲除重組質(zhì)粒PX459后，在目的基因片段序列上設(shè)計(jì)PCR引物，成功重組的質(zhì)�？梢詳U(kuò)出大小約為500bp的片段，未成功構(gòu)建的質(zhì)粒則擴(kuò)不出片段,見圖2B。獲得敲減重組質(zhì)粒PLVX后，由于在質(zhì)粒PLVX兩個(gè)酶切位點(diǎn)EcoRI和BamHI之間只有11bp,而插入的目的片段為60bp左右，因此設(shè)計(jì)了跨酶切位點(diǎn)的PCR引物，成功重組的質(zhì)粒大小約為220bp,而空載質(zhì)粒則出現(xiàn)170bp大小的片段，說(shuō)明PLVX-OPTN構(gòu)建成功，見圖2C。圖2重組質(zhì)粒的初步鑒定Fig2.PreliminaryidentificationofrecombinantplasmidsA:過(guò)表達(dá)質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證（1：過(guò)表達(dá)）；B：敲除質(zhì)粒PCR驗(yàn)證（1、3：對(duì)照；2、4：敲除）；C:敲減質(zhì)粒PCR驗(yàn)證(1：敲減；2：對(duì)照)；M:Marker3.1.3重組質(zhì)粒的測(cè)序驗(yàn)證將初步鑒定成功的重組質(zhì)粒送至上海生工生物有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，從圖譜結(jié)果看出，片段插入的位置正確，和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的堿基序列相同，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒的圖譜見圖3。

重組質(zhì)粒測(cè)序圖譜

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：2980700