骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(Bone morphogenetic protein 9,BMP-9)已被鑒定為在各種組織中調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖,凋亡和分化。然而,其在人卵母細(xì)胞成熟調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的作用及其與卵泡刺激素(Follicle stimulation hormone,FSH)的關(guān)系仍然知之甚少。在這里,我們探討了BMP-9對(duì)體外人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞增殖的影響,并研究了BMP-9對(duì)FSH誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞增殖和類(lèi)固醇激素合成影響的潛在機(jī)制。通過(guò)CCK-8試劑和EdU分析觀察BMP-9對(duì)顆粒細(xì)胞增殖作用。利用RT-PCR及Westernblot技術(shù)測(cè)定FSH在顆粒細(xì)胞BMP-9刺激下誘導(dǎo)的相關(guān)mRNA,蛋白質(zhì)水平。CCK-8結(jié)果顯示,培養(yǎng)基中加入BMP-9上調(diào)顆粒細(xì)胞增殖,并表現(xiàn)劑量100 ng/ml(3.52±0.17倍,P0.05)和時(shí)間依賴性48小時(shí)(0.20±0.11,0.46±0.10,P0.05)。BMP-9與FSH聯(lián)合培養(yǎng)組EdU標(biāo)記細(xì)胞比例大于FSH單獨(dú)培養(yǎng)組(3±0.82,5±0.67,P0.01)。此外,與觀察到的CCK-8細(xì)胞活力趨勢(shì)和EdU測(cè)定一致,BMP-9以劑量依賴性方式增加PCNA的mRNA水平(P0.05),并且增加FSH誘導(dǎo)的PCNA mRNA的表達(dá)。與FSH組相比,Westernblot結(jié)果顯示BMP-9聯(lián)合FSH培養(yǎng)組中,FSHR蛋白水平顯著升高(2±0.02,2.7±0.13,P0.01);PKA蛋白水平均下降(6±0.17,4±0.06,P0.05);Ras(2.2±0.11,3±0.10,P0.01)和Raf蛋白水平(1.9±0.09,2.6±0.16,P0.01)及ERK1/2的磷酸化顯著增加(1.9±0.05,3±0.08,P0.05)。在利用抑制劑阻滯顆粒細(xì)胞中FSHR,PKA,ERK蛋白表達(dá)和cAMP合成后,觀察到PCNA,StAR,3β-HSD和P450arom蛋白水平出現(xiàn)相應(yīng)變化。本研究的結(jié)果表明,BMP-9促進(jìn)基礎(chǔ)與FSH誘導(dǎo)的,與PCNA蛋白表達(dá)相關(guān)的人卵巢顆粒細(xì)胞增殖。此外,BMP-9可能是通過(guò)影響FSH誘導(dǎo)的FSHR,及其cAMP/PKA和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞增殖與類(lèi)固醇的合成。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R711.6
【部分圖文】：

采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示。應(yīng)用足正太方差齊，則使用方差分析對(duì)snq檢驗(yàn)分析。P< 0. 05作為差異顯著結(jié) 果胞的體外分離培養(yǎng)與鑒定人卵巢顆粒細(xì)胞中，具有高度細(xì)胞特和胞質(zhì)，呈棕褐色著染，細(xì)胞核呈深0%，表明分離培養(yǎng)的卵泡顆粒細(xì)胞

CCK8 檢測(cè)一定時(shí)間（0h,12h,24h,36h,48h,60h)內(nèi) BMP9 蛋白干預(yù)原代人卵巢顆粒細(xì)胞（GCs）活力產(chǎn)生的影響。對(duì)照組 OD 值在 12h 開(kāi)始上升，48h 達(dá)頂峰后進(jìn)入平臺(tái)期，各測(cè)量時(shí)間 OD 值與 0h 比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。添加 BMP-9（100ng/ml）組 OD 值在 6h 開(kāi)始上升，48h顯著升高達(dá)到頂峰并進(jìn)入平臺(tái)期，與 0h 比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.2±0.11,0.46±0.10，P<0.05）。OD 值在 36h 顯著升高并高于對(duì)照組最大 OD 值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）(Fig.2A)。2.2 不同濃度 BMP-9 對(duì)顆粒細(xì)胞活力的影響濃度梯度 BMP-9 蛋白（0,5,10,20,50,100ng/ml）干預(yù)原代人卵巢顆粒細(xì)胞（GCs）48 小時(shí)后進(jìn)行 CCK8 試劑檢測(cè)。其結(jié)果顯示：與對(duì)照組（OD值）相比，不同濃度 BMP9 均上調(diào)顆粒細(xì)胞的活性（P<0.05），并隨濃度梯度活性遞增，并在 100ng/ml 對(duì)細(xì)胞活性的影響最為顯著（3.52±0.17 倍，P<0.01）(Fig.2B)。A B

BMP-9 對(duì) rFSH 誘導(dǎo)的人卵巢黃素化顆粒細(xì)-Ethynyl-2’- deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核時(shí)期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的 DN與 Apollo 熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測(cè)細(xì)胞核都顯示出 Hoechst33342 染色的藍(lán)色熒代表正在復(fù)制的細(xì)胞，綠色細(xì)胞數(shù)量/藍(lán)色細(xì) BMP-9 蛋白處理 48h 后，F(xiàn)SH 誘導(dǎo)組與單獨(dú)作用組比較，顯示更大比例的 EdU 標(biāo)記作用組的細(xì)胞增殖率最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig.3）
【參考文獻(xiàn)】

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1 葉婧;丁婷;杜小芳;楊書(shū)紅;沈薇;石良艷;羅愛(ài)月;王世宣;;不同分離方法對(duì)人卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2013年17期

2 靳玉甫;覃愛(ài)平;;卵巢顆粒細(xì)胞P450芳香化酶研究進(jìn)展[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年06期

本文編號(hào)：2886371