目的:沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)為第III類組蛋白去乙酰化酶家族的一員,研究表明SIRT1在多種腫瘤中呈異常表達并與腫瘤的耐藥密切相關。本研究通過細胞水平研究靶向SIRT1的小干擾RNA對宮頸癌Hela細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響,探討其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。在此基礎上將siRNA-SIRT1與順鉑聯(lián)合作用Hela細胞,檢測SIRT1對相關耐藥基因的影響。方法:化學合成靶向SIRT1的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)及其陰性對照序列,應用Lipofectamine RNAi MAX脂質體轉染宮頸癌Hela細胞。實驗分為三組:空白細胞對照組、陰性對照siRNA轉染組和siRNA-SIRT1轉染組。轉染72h后,分別提取各組細胞總RNA和總蛋白。RT-PCR檢測細胞中SIRT1 mRNA的表達;免疫印跡檢測細胞SIRT1蛋白的表達。采用siRNA轉染和順鉑藥物聯(lián)合作用Hela細胞,CCK-8法測定Hela細胞的增殖及順鉑對Hela的IC_(50)值;RT-PCR和qRT-PCR檢測Hela細胞ABCC1和ABCG2 mRNA的表達;免疫印跡法檢測Hela細胞ABCC1蛋白的表達水平;Transwell小室分別檢測細胞的遷移和侵襲能力;流式細胞術檢測Hela細胞凋亡。結果:RT-PCR結果顯示:與陰性對照siRNA組和空白細胞對照組相比,siRNA-SIRT1組SIRT1 mRNA表達均明顯下調(P0.05)。免疫印跡結果顯示:與陰性對照siRNA組和空白對照組相比,siRNA-SIRT1組SIRT1蛋白的表達明顯下調(P0.05)。CCK-8結果顯示:順鉑對Hela細胞的IC_(50)值分別為5.34μM(24h)和3.70μM(48h)。siRNA-SIRT1與順鉑聯(lián)合作用組中順鉑對Hela細胞的IC_(50)為1.58μM(24h),明顯低于單獨順鉑作用組。siRNA-SIRT1組細胞增殖抑制率為28.6%,而陰性對照si RNA組細胞增殖抑制率為6.3%,空白細胞對照組細胞增殖抑制率為4.7%。si RNA-SIRT1轉染組的細胞增殖抑制率明顯高于其他對照組(P0.05)。RT-PCR和qRT-PCR結果均顯示:與陰性對照siRNA組和空白對照組相比,siRNA-SIRT1組ABCC1mRNA的表達明顯下調(P0.05),而ABCG2表達無顯著性差異。免疫印跡結果顯示:與陰性對照siRNA組和空白對照組相比,siRNA-SIRT1組ABCC1蛋白的表達明顯下調(P0.05)。與陰性對照siRNA和順鉑聯(lián)合作用組及空白對照和順鉑聯(lián)合作用組相比,siRNA-SIRT1轉染和順鉑聯(lián)合作用組的ABCC1蛋白的表達明顯下調(P0.05)。細胞遷移和侵襲實驗結果顯示:siRNA-SIRT1轉染組的細胞遷移和細胞侵襲能力均明顯高于其他對照組(P0.05)。流式檢測結果表明:空白細胞對照組細胞的早期凋亡率為2.9%,陰性siRNA對照組細胞的早期凋亡率為3.7%,siRNA-SIRT1組的細胞早期凋亡率為11.7%。與陰性對照si RNA組和空白細胞對照組相比,siRNA-SIRT1組細胞的早期凋亡率明顯提高(P0.05)。結論:siRNA-SIRT1不僅能抑制宮頸癌發(fā)生細胞的增殖、遷移和侵襲,并誘導細胞凋亡,而且可以下調耐藥基因ABCC1的表達,其與順鉑的聯(lián)合作用可以通過降低耐藥基因ABCC1表達進而提高Hela細胞對順鉑的敏感性。SIRT1有望通過影響ABCC1的表達進一步逆轉宮頸癌的化療耐藥。
【學位單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

結果結 果 Hela 細胞 SIRT1 表達的影響ela 細胞 SIRT1 mRNA 水平實驗，選擇最佳轉染濃度為 30nM 的小干陰性對照 siRNA 組和空白細胞對照組均顯對照組及空白細胞對照組相比，siRNA-SIRT降（P<0.05），差異有統(tǒng)計學意義，見圖 1。

12圖 2. siRNA-SIRT1 對 SIRT1 蛋白的表達的影響. Effects of siRNA-SIRT1 on the expressions of SIRT1 proestern blot 結果； B：Western blot 檢測 SIRT1 灰度值對照 siRNA 轉染組、空白對照組相比，***P<0.0001

結果-SIRT1 對 Hela 細胞增殖及順鉑 IC50的影響-8 結果顯示：siRNA-SIRT1 轉染組細胞增殖抑制率為 28.6%，細胞的增殖抑制率為 6.3%，空白細胞對照組細胞增殖抑制率為 siRNA 組和空白對照組相比，siRNA-SIRT1 組細胞的增殖抑制率計學意義（P<0.05）。測得順鉑對 Hela 細胞 24h 的 IC50為 5.34μMM。siRNA-SIRT1 與順鉑聯(lián)合作用，測得順鉑對 Hela 細胞 24h 與單獨順鉑作用相比，siRNA-SIRT1 與順鉑聯(lián)合作用組細胞的 I 3。
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本文編號：2880617