本文關(guān)鍵詞：Illumina高通量測(cè)序技術(shù)觀察剖宮產(chǎn)兒腸道微生物群的演替，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:腸道微生物與人體健康息息相關(guān)。機(jī)體與腸道微生物群間存在多層面互惠互利的共生關(guān)系,腸道微生物群在幫助消化吸收、抵抗致病微生物定植,促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟上均發(fā)揮著重要作用。嬰兒期是腸道微生物群體系建立的關(guān)鍵時(shí)期。分娩方式是影響腸道微生物群的初始定植的重要因素,此時(shí)期腸道微生物群紊亂可能與遠(yuǎn)期如過(guò)敏、肥胖等多種疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。目前的對(duì)腸道微生物群的研究多應(yīng)用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù),如實(shí)時(shí)熒光定量PCR和變性梯度凝膠電泳DGGE,這些方法不僅耗時(shí)而且工作量大,只能檢測(cè)出一定豐度以上的微生物,對(duì)復(fù)雜的腸道微生物群的研究不夠全面。Illumina高通量測(cè)序技術(shù)能夠測(cè)序腸道中所有微生物DNA序列,全面分析腸道微生物落的多樣性和豐度,滿足對(duì)腸道微生物群落的全面認(rèn)識(shí)。本研究采用Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)剖宮產(chǎn)兒生后腸道微生物群的初始定植和演替進(jìn)行動(dòng)態(tài)隨訪觀察,目的為完善和補(bǔ)充以往我們?cè)诖朔矫娴难芯績(jī)?nèi)容,為剖宮產(chǎn)兒腸道微生物群落的演替與遠(yuǎn)期機(jī)體健康和疾病的關(guān)系的研究提供理論依據(jù)。方法:收集2013年11月-2014年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院產(chǎn)科、石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)科分娩的符合入選標(biāo)準(zhǔn)的足月健康剖宮產(chǎn)兒30例。其嬰兒及雙親均生活在石家莊市或其周邊縣市,氣候環(huán)境,居住環(huán)境相當(dāng)。所有入選對(duì)象均在研究開(kāi)始前簽訂知情同意書(shū),并獲河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院倫理道德委員會(huì)同意。收集入組嬰兒出生后第1、3、7天,第1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月齡(分別設(shè)定為T(mén)1-T6組)時(shí)的糞便標(biāo)本凍存于-80℃冰箱。隨訪入組嬰兒各時(shí)間段的喂養(yǎng)狀況、生長(zhǎng)發(fā)育情況以及用藥情況(抗生素及益生菌制劑)。采用E.Z.N.A.#174;Stool DNA Kit試劑盒提取嬰兒糞便微生物的總DNA,并擴(kuò)增16S r RNA基因的V3+V4可變區(qū),應(yīng)用IlluminaMiseq平臺(tái)測(cè)序,全面分析腸道微生物群的構(gòu)成,豐度和多樣性。結(jié)果:1入組剖宮產(chǎn)兒共30例,分別采集生后第1、3、7天,第1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月齡時(shí)這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)糞便標(biāo)本,應(yīng)收集標(biāo)本180份,因各種原因?qū)嵅蓸颖?60份,脫落20份,脫落率為11.1%,其中編號(hào)為3、5、36、46、107、132、138,因標(biāo)本DNA擴(kuò)增失敗,共計(jì)153個(gè)樣本進(jìn)入后續(xù)的高通量測(cè)序分析。對(duì)153份剖宮產(chǎn)兒糞便樣本測(cè)序發(fā)現(xiàn),共獲得2450420個(gè)有效序列,在經(jīng)過(guò)過(guò)濾處理后得到優(yōu)化序列數(shù)為1892051,總堿基數(shù)870289641bp,平均459.97bp。2稀釋曲線表明本研究測(cè)序深度足夠,能覆蓋腸道微生物群97%的菌種。多樣性分析提示生后隨時(shí)間推移糞便樣本中菌群豐度及多樣性逐漸增加。3對(duì)153份剖宮產(chǎn)兒糞便樣本測(cè)序:在門(mén)水平上共檢測(cè)出14個(gè)菌門(mén),其中98%-99%以上主要為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)及Candidate division TM7五個(gè)菌門(mén)。4 30例剖宮產(chǎn)兒糞便微生物群的定植及演替:153份糞便樣品進(jìn)行測(cè)序共測(cè)得183個(gè)菌屬。屬水平上,T1組糞便菌群定植分布相對(duì)均勻,樣本間差異小,以乳球菌屬(Lactococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)及Solibacillus等需氧菌和兼性厭氧菌為優(yōu)勢(shì)菌屬;T2組糞便微生物群構(gòu)成較T1組發(fā)生明顯變化,以埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)、克雷伯桿菌屬(Klebsiella)等兼性厭氧菌為優(yōu)勢(shì)菌群,乳球菌屬、芽孢桿菌屬等所占比例少。T3組糞便標(biāo)本個(gè)體間差異較大,雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium sensustricto)、腸球菌屬(Enterococcus)及韋榮球菌屬(Veillonella)定植增多,埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)、克雷伯桿菌屬(Klebsiella)定植減少。T4組糞便標(biāo)本中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)定植增至24.5%,克雷伯桿菌屬(Klebsiella)減少至20%左右,梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium sensustricto)占10%左右。T5組糞便標(biāo)本中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)為優(yōu)勢(shì)菌屬,克雷伯桿菌屬(Klebsiella)及梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium sensu stricto)定植減少。T6組糞便標(biāo)本間菌屬分布趨于均勻,以雙歧桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)、克雷伯桿菌屬(Klebsiella)及梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium sensu stricto)仍存在。結(jié)論:1 Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)能夠測(cè)序腸道中所有微生物DNA序列,全面分析腸道微生物落的多樣性和豐度,滿足對(duì)腸道微生物群落的全面認(rèn)識(shí)。2對(duì)剖宮產(chǎn)兒腸道微生物群進(jìn)行了全面分析:(1)在門(mén)水平上,共檢測(cè)出14個(gè)菌門(mén),98%-99%以上主要為5個(gè)菌門(mén),分別為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)及Candidate division TM7。(2)在屬水平上共測(cè)得183個(gè)菌屬,主要有埃希氏菌屬、雙歧桿菌屬、克雷伯氏菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、韋榮球菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬等。3動(dòng)態(tài)隨訪觀察了剖宮產(chǎn)兒生后腸道微生物群的初始定植、分布和演替3.1門(mén)水平上,剖宮產(chǎn)兒生后6個(gè)月內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén),豐度較高,其次還有放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。出生后隨時(shí)間推移,厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)是增加的;變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是降低的。3.2屬水平上,剖宮產(chǎn)兒出生后第1天糞便樣本已有大量細(xì)菌定植,主要為乳球菌屬、芽孢桿菌屬及假單胞菌屬等需氧菌和兼性厭氧菌,其大量生長(zhǎng)繁殖消耗消化道內(nèi)大量氧氣,降低了腸道內(nèi)酸堿度和氧化還原電位,為后期厭氧菌的定植打下基礎(chǔ),也表現(xiàn)出后期需氧菌和兼性厭氧菌定植的急劇減少,專(zhuān)性厭氧菌如雙歧桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、腸球菌屬及韋榮球菌屬的快速定植,表現(xiàn)在生后第1個(gè)月時(shí)雙歧桿菌屬明顯增加,至6個(gè)月齡添加輔食后腸道菌群的多樣性和豐度增加,雙歧桿菌屬成為腸道優(yōu)勢(shì)菌。
【關(guān)鍵詞】：高通量測(cè)序 腸道微生物群 足月兒 剖宮產(chǎn) 母乳喂養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R719.8
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫(xiě)10-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-20
• 結(jié)果20-23
• 附圖23-29
• 附表29-31
• 討論31-34
• 結(jié)論34-35
• 參考文獻(xiàn)35-39
• 綜述 剖宮產(chǎn)兒腸道菌群定植模式與遠(yuǎn)期疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)39-48
• 參考文獻(xiàn)43-48
• 致謝48-49
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷49

【引證文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 郭文濤;D-IBS患者腸黏膜優(yōu)勢(shì)菌的改變與TLR2、TLR4表達(dá)的相關(guān)性研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：Illumina高通量測(cè)序技術(shù)觀察剖宮產(chǎn)兒腸道微生物群的演替，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：287942