本文關(guān)鍵詞：Illumina高通量測序技術(shù)觀察剖宮產(chǎn)兒腸道微生物群的演替，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:腸道微生物與人體健康息息相關(guān)。機體與腸道微生物群間存在多層面互惠互利的共生關(guān)系,腸道微生物群在幫助消化吸收、抵抗致病微生物定植,促進免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟上均發(fā)揮著重要作用。嬰兒期是腸道微生物群體系建立的關(guān)鍵時期。分娩方式是影響腸道微生物群的初始定植的重要因素,此時期腸道微生物群紊亂可能與遠期如過敏、肥胖等多種疾病發(fā)生風險增加有關(guān)。目前的對腸道微生物群的研究多應(yīng)用傳統(tǒng)的分子生物學技術(shù),如實時熒光定量PCR和變性梯度凝膠電泳DGGE,這些方法不僅耗時而且工作量大,只能檢測出一定豐度以上的微生物,對復雜的腸道微生物群的研究不夠全面。Illumina高通量測序技術(shù)能夠測序腸道中所有微生物DNA序列,全面分析腸道微生物落的多樣性和豐度,滿足對腸道微生物群落的全面認識。本研究采用Illumina Miseq平臺對剖宮產(chǎn)兒生后腸道微生物群的初始定植和演替進行動態(tài)隨訪觀察,目的為完善和補充以往我們在此方面的研究內(nèi)容,為剖宮產(chǎn)兒腸道微生物群落的演替與遠期機體健康和疾病的關(guān)系的研究提供理論依據(jù)。方法:收集2013年11月-2014年12月在河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院產(chǎn)科、石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)科分娩的符合入選標準的足月健康剖宮產(chǎn)兒30例。其嬰兒及雙親均生活在石家莊市或其周邊縣市,氣候環(huán)境,居住環(huán)境相當。所有入選對象均在研究開始前簽訂知情同意書,并獲河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院倫理道德委員會同意。收集入組嬰兒出生后第1、3、7天,第1個月、3個月和6個月齡(分別設(shè)定為T1-T6組)時的糞便標本凍存于-80℃冰箱。隨訪入組嬰兒各時間段的喂養(yǎng)狀況、生長發(fā)育情況以及用藥情況(抗生素及益生菌制劑)。采用E.Z.N.A.#174;Stool DNA Kit試劑盒提取嬰兒糞便微生物的總DNA,并擴增16S r RNA基因的V3+V4可變區(qū),應(yīng)用IlluminaMiseq平臺測序,全面分析腸道微生物群的構(gòu)成,豐度和多樣性。結(jié)果:1入組剖宮產(chǎn)兒共30例,分別采集生后第1、3、7天,第1個月、3個月和6個月齡時這6個時間點糞便標本,應(yīng)收集標本180份,因各種原因?qū)嵅蓸颖?60份,脫落20份,脫落率為11.1%,其中編號為3、5、36、46、107、132、138,因標本DNA擴增失敗,共計153個樣本進入后續(xù)的高通量測序分析。對153份剖宮產(chǎn)兒糞便樣本測序發(fā)現(xiàn),共獲得2450420個有效序列,在經(jīng)過過濾處理后得到優(yōu)化序列數(shù)為1892051,總堿基數(shù)870289641bp,平均459.97bp。2稀釋曲線表明本研究測序深度足夠,能覆蓋腸道微生物群97%的菌種。多樣性分析提示生后隨時間推移糞便樣本中菌群豐度及多樣性逐漸增加。3對153份剖宮產(chǎn)兒糞便樣本測序:在門水平上共檢測出14個菌門,其中98%-99%以上主要為厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)及Candidate division TM7五個菌門。4 30例剖宮產(chǎn)兒糞便微生物群的定植及演替:153份糞便樣品進行測序共測得183個菌屬。屬水平上,T1組糞便菌群定植分布相對均勻,樣本間差異小,以乳球菌屬(Lactococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)及Solibacillus等需氧菌和兼性厭氧菌為優(yōu)勢菌屬;T2組糞便微生物群構(gòu)成較T1組發(fā)生明顯變化,以埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)、克雷伯桿菌屬(Klebsiella)等兼性厭氧菌為優(yōu)勢菌群,乳球菌屬、芽孢桿菌屬等所占比例少。T3組糞便標本個體間差異較大,雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium sensustricto)、腸球菌屬(Enterococcus)及韋榮球菌屬(Veillonella)定植增多,埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)、克雷伯桿菌屬(Klebsiella)定植減少。T4組糞便標本中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)定植增至24.5%,克雷伯桿菌屬(Klebsiella)減少至20%左右,梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium sensustricto)占10%左右。T5組糞便標本中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)為優(yōu)勢菌屬,克雷伯桿菌屬(Klebsiella)及梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium sensu stricto)定植減少。T6組糞便標本間菌屬分布趨于均勻,以雙歧桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)、克雷伯桿菌屬(Klebsiella)及梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium sensu stricto)仍存在。結(jié)論:1 Illumina Miseq測序平臺能夠測序腸道中所有微生物DNA序列,全面分析腸道微生物落的多樣性和豐度,滿足對腸道微生物群落的全面認識。2對剖宮產(chǎn)兒腸道微生物群進行了全面分析:(1)在門水平上,共檢測出14個菌門,98%-99%以上主要為5個菌門,分別為厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)及Candidate division TM7。(2)在屬水平上共測得183個菌屬,主要有埃希氏菌屬、雙歧桿菌屬、克雷伯氏菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、韋榮球菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬等。3動態(tài)隨訪觀察了剖宮產(chǎn)兒生后腸道微生物群的初始定植、分布和演替3.1門水平上,剖宮產(chǎn)兒生后6個月內(nèi)優(yōu)勢菌門為厚壁菌門和變形菌門,豐度較高,其次還有放線菌門和擬桿菌門。出生后隨時間推移,厚壁菌門和放線菌門是增加的;變形菌門和擬桿菌門是降低的。3.2屬水平上,剖宮產(chǎn)兒出生后第1天糞便樣本已有大量細菌定植,主要為乳球菌屬、芽孢桿菌屬及假單胞菌屬等需氧菌和兼性厭氧菌,其大量生長繁殖消耗消化道內(nèi)大量氧氣,降低了腸道內(nèi)酸堿度和氧化還原電位,為后期厭氧菌的定植打下基礎(chǔ),也表現(xiàn)出后期需氧菌和兼性厭氧菌定植的急劇減少,專性厭氧菌如雙歧桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、腸球菌屬及韋榮球菌屬的快速定植,表現(xiàn)在生后第1個月時雙歧桿菌屬明顯增加,至6個月齡添加輔食后腸道菌群的多樣性和豐度增加,雙歧桿菌屬成為腸道優(yōu)勢菌。
【關(guān)鍵詞】：高通量測序 腸道微生物群 足月兒 剖宮產(chǎn) 母乳喂養(yǎng)
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R719.8
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-20
• 結(jié)果20-23
• 附圖23-29
• 附表29-31
• 討論31-34
• 結(jié)論34-35
• 參考文獻35-39
• 綜述 剖宮產(chǎn)兒腸道菌群定植模式與遠期疾病發(fā)生風險39-48
• 參考文獻43-48
• 致謝48-49
• 個人簡歷49

【引證文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郭文濤;D-IBS患者腸黏膜優(yōu)勢菌的改變與TLR2、TLR4表達的相關(guān)性研究[D];山西醫(yī)科大學;2016年

  本文關(guān)鍵詞：Illumina高通量測序技術(shù)觀察剖宮產(chǎn)兒腸道微生物群的演替，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：287942