目的:研究子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志分子HOXA10蛋白的SUMO化修飾抑制子宮內(nèi)膜容受性和胚胎黏附的分子機(jī)制。方法:通過Western Blot和免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)正常增殖期和分泌期子宮內(nèi)膜以及IVF-ET后反復(fù)種植失敗(Recurrent implantation failure,RIF)患者分泌中期子宮內(nèi)膜中SUMO化修飾蛋白的變化。通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合Western Blot明確HOXA10與SUMO1分子的共價(jià)結(jié)合,并通過HOXA10質(zhì)粒點(diǎn)突變明確其SUMO1修飾位點(diǎn)。體外雌孕激素聯(lián)合刺激子宮上皮Ishikawa細(xì)胞后檢測(cè)HOXA10的SUMO化修飾的變化。子宮內(nèi)膜組織蛋白質(zhì)免疫共沉淀明確RIF患者分泌中期子宮內(nèi)膜中HOXA10的SUMO1修飾改變情況。免疫熒光及核質(zhì)蛋白分離技術(shù)檢測(cè)HOXA10WT SUMO化位點(diǎn)突變的HOXA10K164R的亞細(xì)胞定位。采用放線菌酮阻遏蛋白質(zhì)合成的途徑檢測(cè)SUMO化修飾對(duì)HOXA10蛋白穩(wěn)定性的影響,并通過MG132抑制泛素化降解途徑明確SUMO化修飾調(diào)控HOXA10蛋白穩(wěn)定性的分子機(jī)制。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)SUMO化修飾對(duì)HOXA10轉(zhuǎn)錄活性的影響,并通過DNA-蛋白質(zhì)共沉淀實(shí)驗(yàn)明確SUMO化修飾調(diào)控HOXA10轉(zhuǎn)錄活性的分子機(jī)制。蛋白質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合Western Blot明確SUMO化特異性酯酶SENP1/2介導(dǎo)HOXA10的去SUMO1修飾。通過BeWo囊胚樣細(xì)胞球與子宮內(nèi)膜Ishikawa單層細(xì)胞構(gòu)建的體外胚胎黏附模型檢測(cè)HOXA1O的SUMO化修飾對(duì)BeWo細(xì)胞球黏附率的影響,進(jìn)一步通過小鼠囊胚與Ishikawa細(xì)胞構(gòu)建的體外胚胎黏附模型檢測(cè)HOXA10的SUMO化修飾對(duì)小鼠囊胚黏附強(qiáng)度的影響。結(jié)果:第一部分結(jié)果顯示分泌中期的子宮內(nèi)膜組織中SUMO1修飾蛋白在分子量約 90kDa處顯著降低(P0.05),而 SENP1(P0.01)、SENP2(P0.05)表達(dá)則顯著升高。雌孕激素以時(shí)間依賴性的方式抑制Ishikawa細(xì)胞中分子量約90kDa的SUMO1修飾蛋白表達(dá),SENP1、SENP2的表達(dá)則呈現(xiàn)時(shí)間依賴性增高。RIF患者分泌中期子宮內(nèi)膜中HOXA10的蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組沒有顯著變化(P=0.14),但SUMO1修飾蛋白在腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞中都明顯增高(P0.01)。第二部分結(jié)果顯示雌孕激素能明顯抑制Ishikawa細(xì)胞中HOXA10的SUMO1修飾,且HOXA10蛋白的第164位賴氨酸殘基為SUMO1分子修飾位點(diǎn)。HOXA10WT與SUMO化位點(diǎn)突變的HOXA10K164R都定位于細(xì)胞核中。SUMO化修飾通過促進(jìn)HOXA10WT的泛素化修飾抑制HOXA10WT的蛋白穩(wěn)定性(P0.05),通過抑制HOXA10WT與靶基因啟動(dòng)子區(qū)特異結(jié)合序列的結(jié)合抑制HOXA10WT的轉(zhuǎn)錄活性(P0.001),但不能抑制HOXA10K164R的蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。SENP1、SENP2均能直接介導(dǎo)HOXA10的去SUMO1修飾,并促進(jìn)HOXA10蛋白的穩(wěn)定性(P0.05)。第三部分結(jié)果中體外胚胎粘附模型證實(shí)SUMO1修飾抑制HOXA10WT對(duì)BeWo細(xì)胞球黏附率(P0.01)及其小鼠囊胚黏附強(qiáng)度(P0.01)的促進(jìn)作用,但不能抑制HOXA10K164R的促進(jìn)作用。過表達(dá)SENP2可以逆轉(zhuǎn)HOXA10的SUMO化修飾對(duì)胚胎粘附的抑制作用(P0.01)。RIF患者分泌中期子宮內(nèi)膜中HOXA10的SUMO1修飾水平異常增高(P0.05)。結(jié)論:HOXA10的SUMO化修飾顯著降低HOXA10蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性,并抑制HOXA10介導(dǎo)的BeWo細(xì)胞或小鼠囊胚與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞間的黏附作用,而抑制HOXA10的SUMO化修飾可以改善體外胚胎的粘附。RIF患者子宮內(nèi)膜中異常增高的SUMO1通過翻譯后修飾調(diào)控HOXA10的蛋白功能,進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜容受性和胚胎黏附過程,是其胚胎著床失敗的新分子機(jī)制。檢測(cè)HOXA10蛋白的SUMO化修飾可輔助評(píng)估IVF-ET周期中子宮內(nèi)膜的容受狀態(tài),有利于患者“種植窗口期”的判斷,并可為提高RIF患者胚胎著床率提供研究基礎(chǔ)、拓展治療方向。
【學(xué)位單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R714.8
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 緒論
第二章 反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜中異常的SUMO化修飾蛋白表達(dá)
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
第三章 SUMO化修飾調(diào)控HOXA10的蛋白功能
    前言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
第四章 SUMO修飾抑制HOXA10促進(jìn)胚胎黏附的作用
    前言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
總結(jié)
參考文獻(xiàn)
第五章 綜述
    前言
    子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖對(duì)胚胎種植的作用
    子宮內(nèi)膜細(xì)胞的蛻膜化對(duì)胚胎種植的作用
    子宮內(nèi)膜的容受性
    蛋白翻譯后修飾在子宮內(nèi)膜容受性、蛻膜化過程中的作用
    結(jié)語
    參考文獻(xiàn)
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本文編號(hào)：2876157