目的:碘是合成甲狀腺激素(thyroid hormone,TH)的必備原料,TH對胎兒生長發(fā)育至關重要。母體碘缺乏會造成子代神經發(fā)育損害、運動障礙和認知缺陷。目前,在許多國家(包括一些發(fā)達國家),孕哺期的婦女仍然處于輕度碘缺乏的風險之中。輕度碘缺乏是造成母體及胎兒低甲狀腺素血癥的最常見原因。低甲狀腺素血癥是指血清游離甲狀腺素(free thyroxine,FT_4)水平降低,而促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)和游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine,FT_3)的水平沒有改變。研究表明,對孕哺期重度碘缺乏的母親補碘是有益的,而對于輕度碘缺乏者是否應該補碘還沒有確切依據。一些流行病學研究顯示,對母親進行補碘可能會降低子代認知和行為發(fā)育損害發(fā)生的危險性。然而,又有另外一些研究表明,補碘與兒童神經發(fā)育的損害相關。因此,孕哺期輕度碘缺乏的母親是否應該補碘仍然存在爭議。碘合成的TH是正常小腦功能所必需的激素。小腦維持機體平衡,調控運動協(xié)調功能。浦肯野細胞是小腦唯一傳出神經元,它的樹突長度縮短,分支減少或細胞器形態(tài)發(fā)生改變將導致動物行為學實驗完成度下降,運動協(xié)調功能受損。運動協(xié)調性由興奮性突觸后慢電流(slow excitatory postsynaptic current,sEPSC)調控。sEPSC由浦肯野細胞中Ⅰ型代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor type1,mGluR1)及其下游一系列蛋白構成的信號通路介導。目前,母體孕哺期輕度碘缺乏及補碘是否影響子代小腦浦肯野細胞器形態(tài)及樹突分支復雜性尚不明確,其對子代運動協(xié)調功能及相關的mGluR1信號通路的影響仍亟待回答。因此,本研究通過給予母鼠碘缺乏飼料和含不同濃度碘化鉀的去離子水,建立輕度碘缺乏及補碘模型。探討孕哺期輕度碘缺乏及補碘是否影響子代小腦浦肯野細胞超微結構及樹突形態(tài),進而影響運動協(xié)調功能。以期從行為學、形態(tài)學及分子生物學方面闡述孕哺期輕度碘缺乏及補碘對子代小腦發(fā)育及運動協(xié)調性的影響及相關機制。實驗方法:1、實驗動物與分組。健康2月齡雌性Wistar大鼠60只,按體重隨機分成對照組、輕度碘缺乏組、補碘組和重度碘缺乏組。各組均給予碘缺乏地區(qū)糧食所配制的飼料,飲用含不同濃度碘化鉀的去離子水。雌鼠每日總碘攝入量分別為7.0μg/d、3.0μg/d、3.0μg/d和1.5μg/d。大鼠飼養(yǎng)三個月后,按照雌鼠與雄鼠2:1合籠,從母鼠妊娠(gestational day,GD)0天開始至仔鼠出生后(postnatal day,PN)21天,補碘組雌鼠總碘攝入量上調至7.0μg/d。其它三組飲食飲水情況同前。2、動物血清TH和TSH水平測定。于GD0,對母鼠尾靜脈采血,并分別于PN14和PN21時對仔鼠進行心臟采血,離心機3000 rpm,10 min離心。采用固相化學免疫發(fā)光法測定血清中FT_4、FT_3和TSH水平。3、母鼠尿碘水平測定。分別于母鼠GD0、GD13和GD19用代謝籠收集尿液,采用過硫酸銨消化—砷鈰催化分光光度法測定尿液中碘含量。4、仔鼠行為學實驗。于PN14,對仔鼠進行前肢握力實驗,記錄仔鼠掉落地面的時間。于PN21時分別進行平衡木和旋轉桿實驗,記錄仔鼠通過平衡木及從旋轉桿上掉落所需時間。5、仔鼠小腦浦肯野細胞樹突的形態(tài)學研究。分別取PN14和PN21仔鼠小腦組織進行Golgi-Cox染色后,在顯微鏡下觀察浦肯野細胞樹突形態(tài)。用ImageJ軟件追蹤小腦浦肯野細胞樹突軌跡,測量浦肯野細胞樹突總長度。用Sholl分析方法分析樹突分支復雜程度。6、仔鼠小腦浦肯野細胞電鏡檢測。取各組PN14時仔鼠小腦組織,迅速移入固定液中,經脫水、包埋、切片、染色后,采用透射電鏡觀察小腦浦肯野細胞核及細胞器的改變。7、仔鼠小腦運動協(xié)調性相關蛋白的測定分析。分別于PN14和PN21時,對各組仔鼠斷頭取小腦,采用Western Blot方法測定各組仔鼠小腦Gαq、PLD1、TRPC3和mGluR1的蛋白表達水平。全自動凝膠成像系統(tǒng)拍照,用ImageJ軟件測量各條帶灰度值。8、仔鼠小腦浦肯野細胞mGluR1和TRPC3免疫熒光測定分析。分別取PN14和PN21仔鼠,灌流固定小腦,包埋,制作石蠟切片,觀察小腦浦肯野細胞mGluR1和TRPC3的熒光表達情況。9、統(tǒng)計分析。所有數據均使用軟件SPSS17.0進行分析。計量數據表示為mean±SEM。采用單因素方差分析比較各組間差異。當數據有統(tǒng)計學差異時,使用SNK法進行兩兩比較。當P0.05時,認為有統(tǒng)計學差異。結果:1、孕哺期輕度碘缺乏及補碘影響TH和TSH的表達。在母鼠GD0、仔鼠PN14和PN21,輕度碘缺乏組與對照組相比FT_3和TSH水平無統(tǒng)計學差異(P0.05);補碘組FT_3和TSH水平與對照組和輕度碘缺乏組相比均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。輕度碘缺乏組各時間點FT_4水平均低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在GD0,補碘組母鼠FT_4水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與輕度碘缺乏組相比沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。在PN14和PN21,補碘組仔鼠與對照組相比FT_4水平無統(tǒng)計學差異(P0.05),但高于輕度碘缺乏組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在各時間點,重度碘缺乏組FT_4和FT_3均分別低于對照組和輕度碘缺乏組,而TSH水平均高于對照組和輕度碘缺乏組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、孕哺期輕度碘缺乏及補碘影響尿碘濃度。輕度碘缺乏組母鼠孕早期、孕中期和孕晚期尿碘水平均低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。補碘組母鼠孕早期尿碘水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),與輕度碘缺乏組相比沒有統(tǒng)計學差異(P0.05);孕中期和孕晚期尿碘水平與對照組相比均無統(tǒng)計學差異(P0.05),但均高于輕度碘缺乏組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。重度碘缺乏組母鼠各時期尿碘水平均低于對照組和輕度碘缺乏組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3、孕哺期輕度碘缺乏及補碘影響仔鼠小腦運動協(xié)調性。在PN14前肢握力實驗、PN21旋轉桿實驗和平衡木實驗中,輕度碘缺乏組仔鼠的運動協(xié)調性均比對照組差,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。補碘組仔鼠的運動協(xié)調性與對照組相比均沒有統(tǒng)計學差異(P0.05),但均好于輕度碘缺乏組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。重度缺乏組仔鼠的運動協(xié)調性分別比對照組和輕度碘缺乏組差,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4、孕哺期輕度碘缺乏及補碘影響仔鼠小腦浦肯野細胞樹突形態(tài)。在PN14和PN21,輕度碘缺乏組仔鼠小腦浦肯野細胞樹突總長度及分支復雜程度均低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。補碘組仔鼠小腦浦肯野細胞樹突總長度與對照組相比均沒有統(tǒng)計學差異(P0.05),樹突總長度及分支復雜程度均高于輕度碘缺乏組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。重度缺乏組各時間點仔鼠小腦浦肯野細胞樹突總長度均分別低于對照組和輕度碘缺乏組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5、孕哺期輕度碘缺乏及補碘影響仔鼠小腦浦肯野細胞超微結構。在PN14,輕度碘缺乏組浦肯野細胞超微結構發(fā)生輕微的異常改變,表現為輕微的核膜內陷,部分線粒體嵴斷裂甚至消失。補碘組浦肯野細胞超微結構基本正常,細胞核及細胞器均未發(fā)生改變。重度碘缺乏組浦肯野細胞超微結構受到嚴重損害。浦肯野細胞核皺縮,核膜內陷,邊緣呈鋸齒狀;線粒體吞噬異物并且嵴斷裂,光面內質網腫脹。6、孕哺期對輕度碘缺乏及補碘影響仔鼠小腦運動協(xié)調性相關蛋白表達。在PN14和PN21,輕度碘缺乏組仔鼠小腦mGluR1、Gαq、PLD1和TRPC3蛋白表達水平均低于對照組。補碘組仔鼠小腦mGluR1、Gαq、PLD1和TRPC3蛋白表達水平與對照組相比沒有差異,但均高于輕度碘缺乏組。重度缺乏組仔鼠小腦mGluR1、Gαq、PLD1和TRPC3蛋白表達水平均分別低于對照組和輕度碘缺乏組。結論:1、孕哺期輕度碘缺乏損傷小腦浦肯野細胞樹突發(fā)育和超微結構。2、孕哺期輕度碘缺乏可能通過抑制mGluR1信號途徑而損害小腦運動協(xié)調性。3、妊娠早期補碘可改善由于輕度碘缺乏所造成的小腦浦肯野細胞受損及運動協(xié)調性障礙。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R715.3
【部分圖文】：

圖 3.1 孕哺期輕度碘缺乏及補碘對 TH 和 TSH 水平的影響：母鼠 GD0（n = 6）；仔鼠 PN14（n = 8），PN21（n = 8）。*，與對照；#，與輕度碘缺乏組相比，P < 0.05。）哺期輕度碘缺乏及補碘影響尿碘濃度度碘缺乏組母鼠孕早期、孕中期和孕晚期 UIC 均低于對照組，差異（P < 0.05）。補碘組母鼠孕早期 UIC 低于對照組，差異有統(tǒng)計學，與輕度碘缺乏組相比沒有統(tǒng)計學差異（P > 0.05）；孕中期和對照組相比均無統(tǒng)計學差異（P > 0.05），但均高于輕度碘缺乏組學意義（P < 0.05）。重度碘缺乏組母鼠各時期 UIC 均低于對照組組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（表 3.1）。

圖 3.2 孕哺期輕度碘缺乏及補碘對仔鼠旋轉桿實驗的影響：n = 5-11。*，與對照組相比，P < 0.05；#，與輕度碘缺乏組相比，P < 圖 3.3 孕哺期輕度碘缺乏及補碘對仔鼠平衡木實驗的影響

中國醫(yī)科大學碩士學位論文圖 3.2 孕哺期輕度碘缺乏及補碘對仔鼠旋轉桿實驗的影響注：n = 5-11。*，與對照組相比，P < 0.05；#，與輕度碘缺乏組相比，P <
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本文編號：2872613