發(fā)布時間：2020-11-06 01:09

　　 本論文主要分兩部分,第一部分旨在探究干細(xì)胞因子SALL4對惡性滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響并基于循環(huán)滋養(yǎng)細(xì)胞水平探究惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者中SALL4的表達(dá)情況。培養(yǎng)胎盤絨毛膜癌來源的SALL4高表達(dá)惡性滋養(yǎng)細(xì)胞系JAR,用慢病毒表達(dá)載體分別建立SALL4穩(wěn)定敲低和SALL4穩(wěn)定過表達(dá)的惡性滋養(yǎng)細(xì)胞。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell體外侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SALL4敲低顯著減弱了惡性滋養(yǎng)細(xì)胞JAR的增殖、侵襲遷移能力,而SALL4過表達(dá)則進(jìn)一步增強(qiáng)了 JAR的增殖、侵襲遷移能力。采用流式細(xì)胞術(shù)分析SALL4敲低JAR以及陰性對照細(xì)胞的周期分布,結(jié)果顯示SALL4敲低的JAR細(xì)胞發(fā)生了 G0/G1期阻滯。Western blot和實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示SALL4敲低的惡性滋養(yǎng)細(xì)胞中c-Myc、MMP2、CCND1、β-catenin的蛋白和RNA表達(dá)均下調(diào)。采用微過濾結(jié)合RNAFISH法進(jìn)行CTC富集分析并進(jìn)一步檢測單個CTC中SALL4表達(dá),結(jié)果顯示惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者CTCs總數(shù)、混合型CTCs和間質(zhì)型CTCs數(shù)量要顯著高于正常早孕組,ROC分析結(jié)果顯示三個指標(biāo)最大曲線下面積(AUC)分別為0.776(p=0.001)、0.719(p=0.012)和0.695(p=0.025)。SALL4高表達(dá)CTCs在正常早孕組和良性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病組中無檢出,而在惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者中檢出率達(dá)31.6%(6/19)。因此我們得出結(jié)論,SALL4在惡性滋養(yǎng)細(xì)胞中具有促癌作用,并可能通過激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控c-Myc、CCND1、MMP2的表達(dá),發(fā)揮促進(jìn)絨癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的作用。本研究首次在滋養(yǎng)細(xì)胞疾病患者中研究CTC在惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤輔助診斷中的應(yīng)用價值,表明CTCs在惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤和正常早孕人群中的數(shù)量有顯著差異,并具有較好的診斷效能,提示其可作為β-hcg的補(bǔ)充標(biāo)志物�；贑TCs水平首次在惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)SALL4高表達(dá)CTCs,為SALL4參與惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤發(fā)生發(fā)展提供新的臨床線索。第二部分研究中我們將BIOMED-2引物系統(tǒng)中FR2家族引物應(yīng)用到熔解曲線分析,聯(lián)合FR2和FR3家族引物檢測免疫球蛋白重鏈(IGH)基因重排,并評價改良方法在B細(xì)胞淋巴瘤中的臨床應(yīng)用。收集40例B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤患者的存檔石蠟包埋組織、31例反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增生患者的石蠟包埋組織,合成BIOMED-2系統(tǒng)中針對IGH重排檢測的FR2家族引物七條和FR3家族引物七條以及共同下游引物JH一條,采用含SYBR Green染料的PCR預(yù)混體系通過LightCylcer熒光定量PCR儀檢測,并用傳統(tǒng)BIOMED-2體系聚丙烯凝膠(PAGE)電泳技術(shù)和毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,31例反應(yīng)性增生標(biāo)本檢測結(jié)果均為陰性,特異性為100%。改良方法聯(lián)合FR2和FR3兩家族引物在40例B淋巴瘤石蠟包埋組織標(biāo)本中共檢測出28例克隆性重排,敏感性為70%(28/40),比單獨(dú)使用FR3家族引物靈敏度提高12.5%;同時采用PAGE法對40例B淋巴瘤石蠟包埋組織標(biāo)本進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示熔解曲線分析和PAGE法的一致性為95%;對2例PAGE法檢測無法判讀結(jié)果而熔解曲線分析檢測為陽性的樣本進(jìn)行毛細(xì)管基因掃描,結(jié)果顯示這兩例樣本均為陽性,與熔解曲線分析檢測結(jié)果一致;將Ramos細(xì)胞系用反應(yīng)性增生DNA倍比稀釋后檢測,顯示改良方法的最低檢測限可達(dá)3.125%。綜上所述,改良熔解曲線檢測IGH基因重排,結(jié)果可靠,檢測快速靈敏、通量較高,且有效避免了產(chǎn)物暴露造成的污染,有望成為克隆性重排檢測的新選擇。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

前言??細(xì)胞腫瘤是指胚胎外胚層滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生惡變而形成的腫］，繼發(fā)于妊娠，包括侵襲性葡萄胎、絨毛膜癌、胎盤部位及上皮樣滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤（ＥＴＴ），?ＰＳＴＴ及ＥＴＴ臨床罕見，和絨毛膜癌。滋養(yǎng)細(xì)胞疾病在不同國家發(fā)病率差異較大［Ｐａｌ、新西蘭和歐洲，葡萄胎、絨癌的發(fā)病率分別為０．５７－１．１次妊娠，在東南亞、日本等國家分別為２．０／１０００次妊娠、３．３來各地區(qū)發(fā)病率均呈下降趨勢［Ａｔｒａｓｈ?ｅｔ?ａｌ．，１９８６，?Ｂｒｉｎｔｏｎ?００３］。我國大規(guī)模調(diào)查數(shù)據(jù)顯示良性葡萄胎發(fā)展為侵襲性為２０％左右［石一復(fù)，２００６］，絨癌５０％來源于葡萄胎，２５％月妊娠，其余源于異位妊娠之后［史常旭，２００６］，也有報(bào)道性葡萄胎發(fā)展而來［杜鵬輝，２００５］，侵襲性葡萄胎則均繼發(fā)?

?表１－１?ＲＮＡ?ＦＩＳＨ探針及標(biāo)記焚光素???基因類型?標(biāo)記熒光素?探針靶基因?顯微成像圖顏色??上皮性標(biāo)志物?Ａｌｅｘａ?Ｆｌｕｏｒ?５９４?ＥＰＣＡＭ?紅色信號點(diǎn)??ＣＫ８??ＣＫ１８???ＣＫ１９???間質(zhì)性標(biāo)志物?Ａｌｅｘａ?Ｆｌｕｏｒ?４８８?ＶＩＭＥＮＴＩＮ?綠色信號點(diǎn)???ＴＷＩＳＴ???白細(xì)胞標(biāo)志物?Ａｌｅｘａ?Ｆｌｕｏｒ?７５０?ＣＤ４５?白色信號點(diǎn)??附加探針?Ａｌｅｘａ?Ｆｌｕｏｒ?６４７?ＳＡＬＬ４?紫色信號點(diǎn)??３０??

、敲低ＳＡＬＬ４表達(dá)使ＪＡＲ細(xì)胞增殖能力、侵襲、遷移能力減弱??我們首先對絨癌細(xì)胞系ＪＡＲ進(jìn)行蛋白熒光免疫染色觀察其本底ＳＡＬＬ４表達(dá)情??況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ＪＡＲ細(xì)胞ＳＡＬＬ４蛋白表達(dá)為陽性（圖１－４）。我們用慢病毒包裝質(zhì)??粒ｐＨＲ，－ＣＭＶ－８．９ＡＶＰＲ、ｐＨＲ，－ＣＭＶ－ＶＳＶＧ以及載體質(zhì)粒ｓｈＲＮＡｐＬｅｎｔｉＬｏｘ３．７（圖??１－５Ａ）構(gòu)建陰性對照和ｓｈ－ＳＡＬＬ４的慢病毒表達(dá)載體，再經(jīng)慢病毒侵染ＪＡＲ細(xì)胞，??建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系ｓｈ－ＳＡＬＬ４－ＪＡＲ和ｓｈ－ＮＣ－ＪＡＲ。慢病毒插入序列經(jīng)過測序驗(yàn)證，??序列如下：??ｓｈ－ＳＡＬＬ４：?５＇－ＣＴＡＴＴＴＡＧＣＣＡＡＡＧＧＣＡＡＡ－３＇??ｓｈ－ＮＣ：?５＇－ＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴ－３＇??采用ＲＴ－ｑＰＣＲ以及蛋白免疫印跡驗(yàn)證ｓｈ－ＳＡＬＬ４－ＪＡＲ的ＳＡＬＬ４表達(dá)在ＲＮＡ??水平和蛋白水平均顯著下調(diào)（圖１－６）。采用ＣＣＫ８細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)對比ＳＡＬＬ４干擾??細(xì)胞與陰性對照細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示ＳＡＬＬ４干擾后，ＪＡＲ細(xì)胞的增殖能力??顯著減弱（圖１－７）。采用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵襲試驗(yàn)和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ遷移試驗(yàn)對比ＳＡＬＬ４干??擾細(xì)胞與陰性對照細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，結(jié)果顯示，ＳＡＬＬ４干擾后細(xì)胞的侵襲能??力和轉(zhuǎn)移能力都顯著減弱（圖１－８）。??陰忭對照?ｊＡＲ細(xì)胞??由圖可見，正常人白細(xì)胞（陰性對照）ＳＡＬＬ４表達(dá)為陰性，ＪＡＲ細(xì)胞ＳＡＬＬ４??表達(dá)陽性??圖１－?４?ＪＡＲ細(xì)胞ＳＡＬＬ４免疫熒光染色??３５??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2872453