背景和目的宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅女性健康,其發(fā)病呈年輕化趨勢,且發(fā)病率呈逐年升高,對(duì)患者的身心健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。宮頸癌的主要病因是高危型人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)感染,HPV編碼的病毒癌蛋白可影響細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡和分化,使抑癌基因和促凋亡蛋白失活或降解,進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生癌變。傳統(tǒng)的手術(shù)及放、化療在局部晚期宮頸癌及復(fù)發(fā)性宮頸癌患者中未能取得滿意的療效。靶向治療在細(xì)胞分子水平上,對(duì)已明確的致癌位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療藥物,藥物在體內(nèi)特異性結(jié)合致癌位點(diǎn),使腫瘤細(xì)胞特異性死亡,而對(duì)正常組織細(xì)胞無殺傷作用。最新的靶向治療和免疫治療研究方面取得了較為滿意的進(jìn)展,為患者帶來新的選擇和希望。因此,函待開發(fā)更多有效的靶向藥物,必將為宮頸癌患者的治療提供更多的益處。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子(The tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand,TRAIL)是一種能特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞死亡受體的因子,其可通過結(jié)合死亡受體結(jié)構(gòu)域,啟動(dòng)下游凋亡程序,高效性、高選擇性的誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡,對(duì)正常組織和細(xì)胞無明顯毒性副作用,是較為有效的分子靶向治療位點(diǎn)。TRAIL因其對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異殺傷作用而有廣泛的應(yīng)用前景,但許多臨床研究表明癌細(xì)胞產(chǎn)生TRAIL耐藥性,最終逃避TRAIL誘導(dǎo)的凋亡。明確TRAIL激活凋亡的機(jī)制對(duì)于開發(fā)TRAIL在臨床應(yīng)用中最大限度發(fā)揮其潛在有效性的策略至關(guān)重要。σ受體(σR)是一種獨(dú)特的非阿片受體蛋白,可分為σ1R和σ2R兩種亞型,σR具有不同的組織分布、細(xì)胞功能和藥理特征。σ1R是一種主要位于線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)特殊的跨膜蛋白,可以和其他蛋白(如N-甲基-D-天冬氨酸和阿片受體)相互作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白的合成和活性,其配體拮抗劑可用于治療精神疾病、疼痛、誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。高水平的σ1R使前列腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL治療具有更強(qiáng)的耐受性,σ1R在TRAIL誘導(dǎo)的Caspase激活中起著關(guān)鍵的作用;σ1R使人乳腺癌對(duì)TRAIL敏感,為TRAIL誘導(dǎo)腫瘤特異性殺傷的關(guān)鍵介質(zhì)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織尤其是宮頸腺癌和宮頸癌細(xì)胞系Siha和Hela細(xì)胞中存在σ1R高表達(dá),自主合成的σ1R配體化合物可顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的生長。本研究將探討σ1R配體化合物、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子(TRAIL)誘導(dǎo)劑、σ1R降調(diào)對(duì)宮頸癌Siha、Hela細(xì)胞增殖、遷移、克隆、凋亡等生物學(xué)行為的影響。為宮頸癌的靶向治療提供更多的思路和理論依據(jù)。材料與方法σ1R拮抗劑BD1063、σ1R激動(dòng)劑Avex-73、TRAIL誘導(dǎo)劑TIC10。MTT比色法檢測配體化合物對(duì)細(xì)胞增殖的影響、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測化合物對(duì)細(xì)胞遷移的影響、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測化合物對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響、流式細(xì)胞術(shù)檢測化合物對(duì)細(xì)胞凋亡作用、Western Blot技術(shù)檢測化合物作用后σ1R蛋白及凋亡蛋白的表達(dá)。構(gòu)建σ1R載體質(zhì)粒sh RNA及上調(diào)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Siha、Hela細(xì)胞后觀察其對(duì)細(xì)胞增殖和σ1R蛋白及凋亡蛋白的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用sx±表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間兩兩比較采用最小顯著差數(shù)t檢驗(yàn)(LSD-t檢驗(yàn)),多組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以率表示,采用χ2檢驗(yàn)。以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.MTT顯示:σ1R拮抗劑BD1063及TRAIL誘導(dǎo)劑TIC10以濃度和時(shí)間依賴性抑制Siha、Hela細(xì)胞增殖(P0.01)。Siha、Hela細(xì)胞作用48h,BD1063的IC50值分別為47.45μmol/L和38.37μmol/L,TIC10的IC50值分別為30.86μmol/L和31.32μmol/L;2.BD1063對(duì)TRAIL增敏作用:6μmol/L的BD1063聯(lián)合不同濃度TIC10,對(duì)細(xì)胞抑制效果顯著高于單用TIC10(P0.01);3.化合物對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響:48μmol/L BD1063和40μmol/L的TIC10作用24h后,Siha、Hela細(xì)胞遷移率均明顯小于對(duì)照組(P0.01);4.化合物對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響:48μmol/L BD1063和40μmol/L的TIC10作用2周后克隆形成率均明顯小于對(duì)照組(P0.01);5.化合物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響:48μmol/L BD1063和40μmol/L的TIC10作用48h后,細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(P0.01);6.Western blot顯示:BD1063聯(lián)合TIC10作用后,σ1R表達(dá)水平降低,cleaved caspase-3、cleaved caspase-8蛋白表達(dá)顯著增高(P0.05);7.降調(diào)σ1R:σ1R的sh RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后均可顯著抑制細(xì)胞增殖(P0.01),其中932質(zhì)粒抑制效果最好;降調(diào)σ1R后聯(lián)合TIC10作用48h,對(duì)Siha、Hela細(xì)胞的抑制率明顯高于TIC10(P0.01);8.BD1063對(duì)Ha Cat細(xì)胞無明顯增殖抑制作用;Avex-73和σ1R上調(diào)質(zhì)粒對(duì)Siha、Hela、Ha Cat細(xì)胞無明顯增殖抑制作用(P0.05)。結(jié)論1.σ1R拮抗劑BD1063和TRAIL誘導(dǎo)劑TIC10均呈濃度梯度和時(shí)間依賴性抑制Siha、Hela細(xì)胞增殖。2.BD1063和TIC10可抑制Siha、Hela細(xì)胞遷移;降低Siha、Hela細(xì)胞克隆形成率;增加Siha、Hela細(xì)胞凋亡。3.低濃度BD1063可增加Siha、Hela細(xì)胞對(duì)TIC10的敏感性。4.σ1R的sh RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可降低σ1R表達(dá)并增加Siha、Hela細(xì)胞對(duì)TIC10的敏感性。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

16圖 1 σ1R shRNA 和 A1826-2 上調(diào)質(zhì)粒在宮頸癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率A：σ1R shRNA 和 A1826-2 上調(diào)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Siha、Hela 細(xì)胞 6h 后，轉(zhuǎn)染率均達(dá) 60%左右；B：σ1R shRNA 和 A1826-2 上調(diào)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Siha、Hela 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率對(duì)比柱狀圖。

圖 2 不同濃度 σ1R 拮抗劑 BD1063 對(duì) Siha、Hela 細(xì)胞增值抑制率的比較A：BD1063 呈濃度和時(shí)間依賴性抑制 Siha 細(xì)胞的生長（P＜0.01）；B：BD1063 呈濃度和時(shí)間依賴性抑制 Hela 細(xì)胞的生長（P＜0.01）。表 4 不同濃度的 σ1R 拮抗劑 BD1063 對(duì) HaCat 細(xì)胞增殖抑制率的比較（%，x ±s）化合物濃度（μmol/L） 樣本數(shù)（n） 24h 48h 72h1.5 12 0.01±1.70 1.59±0.87 3.68±3.703 12 1.07±1.03 3.39±2.30 4.24±2.856 12 1.91±1.02 4.41±3.95 6.26±3.5212 12 2.27±1.30 4.36±3.84 6.99±2.7624 12 2.40±1.13 6.35±2.82 7.75±3.4648 12 3.41±1.48 7.33±2.85 8.78±3.1296 12 3.74±2.03 8.15±3.14 9.19±3.44192 12 3.67±1.92 7.97±3.13 8.72±3.29IC50值 — — —F — — —P — — —

2.4 σ1R 拮抗劑、TRAIL 誘導(dǎo)劑對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，48μmol/L BD1063 作用 Siha 和 Hela 細(xì)胞 24h 后，Siha細(xì)胞遷移率[（19.42±1.32）%]、Hela 細(xì)胞遷移率[（24.62±2.37）%]，均顯著小于對(duì)照組 Siha[（41.34±2.45）%]、Hela[（39.42±9.06）%]，tSiha=19.28，PSiha＜0.01和 tHeLa=7.92，PHela＜0.01。40μmol/L TIC10 作用 24h 后，Siha 細(xì)胞遷移率[（17.19±1.67）%]、Hela 細(xì)胞遷移率[（20.08±3.51）%]，均顯著小于對(duì)照組Siha（[41.34±2.45）%]和 Hela（[39.42±9.06）%]，tSiha=19.92，PSiha＜0.01 和 tHeLa=9.01，PHela＜0.01。見圖 3。
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