目的:子宮內(nèi)膜癌是嚴重威脅女性健康的生殖道惡性腫瘤之一,近年來發(fā)病率逐年增加。手術治療是子宮內(nèi)膜癌主要的治療手段,術后需要輔以化療或其他輔助治療,預后欠佳,缺乏有效的預防措施。目前公認長期無孕激素拮抗的雌激素作用是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的主要原因,而高血壓、肥胖、糖尿病被認為是子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的高危因素,通常被稱為“子宮內(nèi)膜癌三聯(lián)征”。隨著我國肥胖女性數(shù)量增加,子宮內(nèi)膜癌也呈現(xiàn)發(fā)病率高及年輕化的趨勢,很多未生育女性因子宮內(nèi)膜癌或癌前病變切除子宮失去生育能力。流行病學數(shù)據(jù)表明,肥胖至少與40%的子宮內(nèi)膜癌發(fā)生有關,肥胖人群子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率是普通人群的2-3倍。原因在于超重或肥胖女性的內(nèi)源性雌激素水平升高,子宮內(nèi)膜長期暴露于雌激素的作用下,會導致子宮內(nèi)膜增生及潛在的不典型增生。糖尿病會增加子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風險也已經(jīng)得到了充分證實。糖尿病婦女患子宮內(nèi)膜癌的風險比非糖尿病婦女高。有學者認為可以將子宮內(nèi)膜癌看作是一組代謝異常的征候群,針對發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的高危因素改變個人生活習慣、節(jié)制飲食、加強鍛煉,控制肥胖、糖尿病、高血壓等代謝性疾病可以幫助降低子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風險。由于子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率高,又缺乏有效的治療措施,因此尋找有效的預防手段對于降低子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率和保護女性健康及生育功能具有重要意義。利用安全有效的藥物進行化學預防是非常有前景的研究方向,尤其對于子宮內(nèi)膜早期病變以及有保留生育功能要求的女性患者。癌癥化學預防(Chemorevention)這個名詞在1976年由Michael Sporn創(chuàng)造,現(xiàn)在被美國國立癌癥研究所(NCI)以及其它多個機構和個人所公認的定義為:利用天然、合成或生物物質來阻止、減緩或者逆轉癌癥發(fā)生發(fā)展過程,從而達到降低癌癥的發(fā)生率和死亡率的方法、策略。小檗堿(Berberine,BBR)是一種擁有多個作用靶點的藥物,在體應用BBR能夠促進高能量介導的分解代謝。無論動物試驗還是臨床研究,BBR在糖代謝、脂代謝、糖尿病治療、內(nèi)皮作用及心血管系統(tǒng)的作用均得到了令人滿意的結果。綜上,肥胖、糖尿病是子宮內(nèi)膜癌的高危因素,控制肥胖、糖尿病等代謝性疾病可以幫助減少子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生;而BBR對肥胖、糖尿病等糖脂代謝紊亂性疾病具有很好的治療效果,同時由于BBR應用歷史悠久,具有很好的安全性,因此可以嘗試利用BBR進行子宮內(nèi)膜癌的化學預防與治療。本課題擬通過研究BBR對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的抑制作用,并深入研究其作用機制,探討將BBR應用于治療子宮內(nèi)膜癌的可能性。方法:1、研究對象:子宮內(nèi)膜癌RL95-2、HEC-1-A及及AN3 CA細胞系;采集共15個EC組織和匹配的病灶周圍正常子宮內(nèi)膜組織,所有標本均采自因EC于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院手術治療的患者。手術切除后立即在液氮中冷凍,并在-80℃保存直至使用。5-6周齡裸鼠。2、研究方法:(1)第一部分:首先,體外培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌RL95-2細胞系及HEC-1-A細胞系,分別用不同濃度的BBR作用于兩種細胞系,MTS法檢測BBR對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的抑制作用,采用流式細胞術方法檢測BBR作用對子宮內(nèi)膜癌細胞周期的影響。然后采用Western blotting方法檢測BBR誘導細胞凋亡過程中凋亡相關蛋白caspase-3、caspase-9的變化,然后用JC-1染色法研究BBR作用前后細胞內(nèi)線粒體膜電位的變化。采用葡萄糖氧化酶法和乳酸氧化酶法分別檢測BBR作用前后子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)葡萄糖消耗量及乳酸生成量的變化。Western blotting方法檢測BBR作用前后子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)p-AMPK,AMPK,p-mTOR,mTOR蛋白表達變化情況,然后向細胞內(nèi)加入AMPK特異性抑制劑compound C,再次檢測BBR作用前后子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)p-AMPK,AMPK,p-mTOR,mTOR蛋白表達變化。(2)第二部分:培養(yǎng)人類EC細胞AN3 CA和HEC-1-A細胞,并采集共15個EC組織和匹配的正常組織。用脂質體?2000分別轉染miR-101,及含有雜亂miRNA的miR-101抑制劑為陰性對照(NC)。逆轉錄-定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測mRNA的表達的差異。細胞活力測定和集落形成試驗,使用細胞計數(shù)試劑盒8(CCK8)評估細胞存活率。BBR處理細胞后分析細胞的生存能力�？寺⌒纬蓪嶒炘u價細胞集落形成能力的變化。采用24孔trans-well小室進行細胞侵襲和遷移試驗檢測EC細胞侵襲和遷移變化。Western blotting分析COX-2蛋白表達變化。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定培養(yǎng)基中釋放的PGE2水平。報告質粒構建,pGL3-Basic-pri-miR-101-2啟動子及對照質粒pRL-SV40轉染入EC細胞,BBR處理細胞后,進行雙熒光素酶報告基因分析,測量螢火蟲和海腎熒光素酶的活性。腫瘤異種移植,HEC-1-A細胞皮下植入5-6周齡裸鼠右側腹壁,當腫瘤體積約為150-200毫米~3,選擇性的分別給小鼠口服0.5%MC、不同劑量BBR,用卡尺每3天測量各組腫瘤體積。EC肺轉移小鼠模型,通過向裸鼠尾靜脈注射HEC-1-A cells細胞建立肺轉移小鼠模型。處理4周后,計數(shù)宏觀肺轉移數(shù)。結果:MTS結果顯示BBR作用于兩種細胞后,兩種細胞增殖速率均明顯降低,且這種作用呈現(xiàn)時間及劑量依賴性(10%FBS)。流式細胞術結果顯示,BBR作用于兩種細胞后,細胞周期受到阻滯,處于G1/G0期的細胞所占的比例明顯增加,而處于S、G2/M期的細胞所占的比例則明顯降低。western blotting結果顯示,BBR作用后,Rl95-2細胞內(nèi)cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的表達量顯著增加,而在HEC-1-A細胞內(nèi),cleaved-caspase-3蛋白表達無明顯差異。JC-1染色結果顯示,BBR能使兩種細胞線粒體膜電位均減弱。葡萄糖氧化酶法及乳酸氧化酶法結果顯示,BBR作用后,兩種細胞內(nèi)均表現(xiàn)葡萄糖消耗量及乳酸生成量明顯增加。western blotting結果顯示,BBR作用于RL95-2細胞后,細胞內(nèi)p-AMPK逐漸增加,而p-mTOR逐漸減少;而預先加入AMPK特異性抑制劑后,BBR激活AMPK的作用被減弱,但p-mTOR蛋白表達與單純BBR作用時沒有明顯差異。BBR能以劑量和時間依賴性顯著抑制AN3 CA和HEC-1-A EC細胞的增殖。同樣,細胞集落形成實驗也表明BBR處理后顯著抑制AN3 CA和HEC-1-A EC細胞的集落形成能力。動物實驗顯示,口服黃連素50毫克/千克和100毫克/千克顯著誘導腫瘤模型的腫瘤生長的抑制作用。改良的Boyden小室法檢測細胞遷移及侵襲能力變化,結果表明,BBR顯著抑制AN3 CA和HEC-1-A EC細胞的遷移能力,BBR治療能夠引起AN3 CA和HEC-1-A EC細胞的浸潤明顯減少。小鼠肺轉移模型觀察BBR對EC細胞轉移的影響。結果發(fā)現(xiàn)給予BBR后,導致轉移結節(jié)數(shù)明顯減少,且呈現(xiàn)劑量依賴性。BBR作用于AN3 CA和HEC-1-A EC細胞后,以濃度依賴性的方式顯著的抑制COX-2的表達。ELISA方法檢測BBR治療后前列腺素E2蛋白水平的變化,結果表明BBR同樣以劑量依賴性的方式顯著抑制PGE2水平。我們在HEC-1A細胞中存在或缺失COX-2過表達的情況下分別用BBR處理細胞,結果發(fā)現(xiàn)COX-2過表達使細胞存活率增加2.3倍,而在50μMBBR作用后COX-2的作用被抑制。HEC-1A細胞過表達COX-2時顯示細胞遷移和侵襲能力顯著上調(diào)。而BBR治療后削弱了COX-2對于細胞活力及浸潤能力的影響。與相匹配的正常組織相比,EC腫瘤組織中miR-101的表達顯著下調(diào),而COX-2蛋白水平明顯上調(diào)。熒光定量PCR和Western blotting分析也證實了通過miR-101介導的對COX-2的調(diào)節(jié)作用。用的BBR處理細胞后發(fā)現(xiàn),BBR刺激miR-101的表達,且呈現(xiàn)劑量依賴性。BBR誘導熒光素酶活性增加,而AP-1結合位點敲除后削弱了BBR誘導熒光素酶活性的作用。此外,miR-101抑制劑和BBR共同作用于HEC-1A細胞時,BBR誘導COX-2表達增加的作用被抑制。結論:BBR能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖,促使細胞周期阻滯,對表達和不表達雌激素受體的子宮內(nèi)膜癌細胞均有顯著的抑制作用;BBR抑制子宮內(nèi)膜癌細胞線粒體氧化功能,促進細胞無氧代謝;BBR通過對線粒體的抑制發(fā)揮對子宮內(nèi)膜癌細胞的抑制作用;BBR能夠以不依賴于AMPK通路的方式抑制RL95-2細胞的代謝核心分子mTOR。BBR抑制體外和體內(nèi)EC細胞的生長、細胞遷移和侵襲,對腫瘤轉移的調(diào)控起著至關重要的作用;BBR通過COX-2/PGE2軸介導抑制EC細胞存活、遷移和侵襲;miR-101參與了BBR對COX-2的調(diào)控。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

3 結果3.1 BBR 能夠有效抑制兩種子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖MTS 結果顯示，在 10%FBS 培養(yǎng)基條件下，BBR 作用于 2 種內(nèi)膜癌細胞后，細胞增殖速率均明顯降低，在相同濃度下，BBR 作用 72 小時時，2 種細胞增殖速率均低于作用 48 小時，圖 1AB。更換 1%FBS 培養(yǎng)基條件下，BBR 作用于兩種細胞后，細胞增殖速率同樣均明顯降低（P<0.05）。但在 0-5 μmol/L 及 160 μmol/L 濃度條件下時，隨著 BBR 作用時間延長，細胞增殖速率無名顯差異，在 10-80 μmol/L濃度條件下時，細胞增殖速率因作用時間長而明顯降低。圖 1CD。最后，應用無FBS 的培養(yǎng)基，因細胞生存條件較差，改為作用 24h、48h 后進行 MTS 實驗，結果顯示，細胞增殖速率隨 BBR 作用濃度增加而明顯降低，但在相同濃度下，隨作用時間延長，細胞增殖速率無明顯差異。圖 1EF。

率均低于作用 48 小時，圖 1AB。更換 1%FBS 培養(yǎng)基條件下，BBR 作用于兩種細胞后，細胞增殖速率同樣均明顯降低（P<0.05）。但在 0-5 μmol/L 及 160 μmol/L 濃度條件下時，隨著 BBR 作用時間延長，細胞增殖速率無名顯差異，在 10-80 μmol/L濃度條件下時，細胞增殖速率因作用時間長而明顯降低。圖 1CD。最后，應用無FBS 的培養(yǎng)基，因細胞生存條件較差，改為作用 24h、48h 后進行 MTS 實驗，結果顯示，細胞增殖速率隨 BBR 作用濃度增加而明顯降低，但在相同濃度下，隨作用時間延長，細胞增殖速率無明顯差異。圖 1EF。1A， RL95-2 細胞生長曲線 圖 1B，HEC-1-A 細胞生長曲線

率均低于作用 48 小時，圖 1AB。更換 1%FBS 培養(yǎng)基條件下，BBR 作用于兩種細胞后，細胞增殖速率同樣均明顯降低（P<0.05）。但在 0-5 μmol/L 及 160 μmol/L 濃度條件下時，隨著 BBR 作用時間延長，細胞增殖速率無名顯差異，在 10-80 μmol/L濃度條件下時，細胞增殖速率因作用時間長而明顯降低。圖 1CD。最后，應用無FBS 的培養(yǎng)基，因細胞生存條件較差，改為作用 24h、48h 后進行 MTS 實驗，結果顯示，細胞增殖速率隨 BBR 作用濃度增加而明顯降低，但在相同濃度下，隨作用時間延長，細胞增殖速率無明顯差異。圖 1EF。1A， RL95-2 細胞生長曲線 圖 1B，HEC-1-A 細胞生長曲線

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