目的:哺乳動物的妊娠過程涉及到胚胎著床、胎盤形成、胚胎發(fā)育和分娩等多個環(huán)節(jié),是一個極其精細且復(fù)雜的過程。胚胎著床后,位于系膜對側(cè)胚胎周圍的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞進行增殖和分化,即蛻膜化(decidualization)。蛻膜細胞在子宮的橫切面會形成兩個明顯的區(qū)域:圍繞著胚胎的無血管的初級蛻膜區(qū)(primary decidualization zone,PDZ)和緊鄰初級蛻膜區(qū)廣泛分布血管的次級蛻膜區(qū)(secondary decidualization zone,SDZ)�；|(zhì)細胞蛻膜化是胚胎著床過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。蛻膜化的機制目前依然尚未研究全面。高遷移率族蛋白B1(high motility group B1,Hmgb1)對于哺乳動物生命的存續(xù)是必須的。以往關(guān)于Hmgb1在妊娠中的作用研究集中在Hmgb1對囊胚發(fā)育的影響,Hmgb1在妊娠早期子宮中的作用及功能暫無研究。本課題組前期的表達譜測序發(fā)現(xiàn)Hmgb1在子宮內(nèi)膜蛻膜化組織中表達上調(diào)。因此,本研究首先擬探討Hmgb1與子宮內(nèi)膜蛻膜化之間的關(guān)系。此外,Hmgb1在線粒體的質(zhì)量控制(能量代謝系統(tǒng)、線粒體自噬以及線粒體融合/分裂)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。而高能量驅(qū)動的線粒體活性在多倍體蛻膜細胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用,以支持子宮內(nèi)膜的分化和胚胎植入。線粒體功能異常導(dǎo)致的蛻膜細胞多倍化受損可能導(dǎo)致不孕。因此,本研究欲探討的第二個問題,即Hmgb1在蛻膜化過程中是否調(diào)控線粒體質(zhì)量控制。另外,Hmgb1在核內(nèi)能夠促進類固醇激素受體(ER/PR)等轉(zhuǎn)錄因子與靶DNA的結(jié)合,調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、表達及細胞分化等生命活動。雌激素受體(ERα和ERβ)和孕激素受體(PR-A和PR-B)在胚胎著床和蛻膜化中擔(dān)負(fù)重要的角色。因此,本研究擬探討第三個問題:核內(nèi)Hmgb1是否轉(zhuǎn)錄調(diào)控ER/PR應(yīng)答基因而影響蛻膜化過程。被釋放到胞外的Hmgb1可與多種受體如RAGE,TLR4,TLR9等相互作用調(diào)控免疫過程。蛻膜化過程中會有多種免疫細胞的參與。因此,本文擬探討的第四個問題:釋放到胞外的Hmgb1是否會調(diào)控免疫從而影響蛻膜化過程。本文研究了Hmgb1在圍著床期的表達規(guī)律及其調(diào)控小鼠蛻膜化過程的分子機制,以全面了解Hmgb1在圍著床期的作用,為蛻膜化的研究提供新的有力證據(jù)。方法:1.建立動物孕期模型:小鼠正常妊娠模型:8周齡性成熟昆明雌鼠(體重28-30g)與性成熟雄鼠合籠交配,次日早晨檢查陰栓,見陰栓記為孕第一天(D1)。取小鼠妊娠D1,D4,D5,D6,D8子宮內(nèi)膜組織材料(8只/天)。小鼠假孕模型:8周齡性成熟昆明雌鼠與結(jié)扎輸精管雄鼠合籠交配,次日早晨檢查陰栓,見陰栓記為假孕第一天(PD1)。取小鼠假孕PD1,PD4,PD5,PD6,PD8子宮內(nèi)膜材料(8只/天)。小鼠延遲著床模型:妊娠D3小鼠晚上被切除雙側(cè)卵巢。在妊娠D4-D7早晨給予切除卵巢的小鼠皮下注射孕酮100μl(1mg/0.1ml玉米油)。妊娠D7天將小鼠分為兩組:一組繼續(xù)皮下注射孕酮100μl(1mg/0.1ml玉米油),記為延遲著床組(5只/組)。另一組皮下注射孕酮100μl(1mg/0.1ml玉米油)和雌二醇100μl(25ng/0.1mL玉米油),記為延遲著床激活組(5只/組)。D8脫頸處死小鼠,延遲組用生理鹽水沖洗子宮后檢測是否有延遲著床的胚胎,激活組尾靜脈注射1%臺盼藍溶液,檢測是否有著床的胚胎。人工誘導(dǎo)蛻膜化模型:8周齡性成熟昆明雌鼠與結(jié)扎輸精管雄鼠合籠交配,次日早晨檢查陰栓,見陰栓記為假孕第一天(PD1)。PD4清晨小鼠子宮一側(cè)宮角注射玉米油5μl,對側(cè)子宮注射等量PBS作為對照(8只/組)。至PD8早晨取子宮內(nèi)膜材料。宮角注射:小鼠于假孕第四天(PD4)上午進行宮角注射Hmgb1抑制劑甘草酸,雙側(cè)子宮角一側(cè)注射5μl甘草酸(glycyrrhizia acid,GA)+玉米油(Oil)混合液(5mM),對側(cè)宮角注射5μl玉米油(含等量甘草酸溶劑DMSO),于PD8收集子宮內(nèi)膜材料(5只/組)。另外5只PD4小鼠,一側(cè)宮角注射5μl玉米油(含甘草酸溶劑DMSO),對側(cè)宮角注射等量DMSO,PD8收集子宮材料(5只/組)。另外5只PD4小鼠一側(cè)子宮角注射5μl PBS作為對照,對側(cè)子宮角注射等量DMSO,于PD8收集子宮材料(5只/組)。2.細胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型:原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞培養(yǎng)液中加入最終濃度為10nM雌二醇(E_2)與1μM孕酮(P_4)誘導(dǎo)72h,對照組加入溶劑無水乙醇作為對照。3.Hmgb1的表達與蛻膜化的關(guān)系:(1)子宮內(nèi)膜蛻膜化檢測:觀察圍著床期小鼠蛻膜化時期(D5-D8)子宮外觀。人工誘導(dǎo)蛻膜化后,對子宮稱重,RT-qPCR檢測蛻膜化標(biāo)識分子dtprp的mRNA水平,以驗證人工誘導(dǎo)蛻膜化是否成功。體外功能實驗,誘導(dǎo)蛻膜化利用雌孕激素誘導(dǎo)小鼠原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞,采用RT-qPCR檢測dtprp的mRNA水平。(2)Hmgb1在圍著床期的表達:免疫組化(IHC)、原位雜交(ISH)、Western Blot、RT-qPCR檢測在D1、D4、D5IS(著床點)、D5IIS(著床旁)、D6IS、D6IIS、D8IS天Hmgb1的表達情況;(3)Hmgb1在假孕期的表達:IHC、Western Blot、RT-qPCR檢測在PD1、PD4、PD5、PD6、PD8天Hmgb1的表達情況;(4)Hmgb1在延遲著床模型的表達:IHC檢測在延遲著床組與激活組Hmgb1的表達;(5)Hmgb1在人工誘導(dǎo)蛻膜化模型的表達:IHC、Western Blot、RT-qPCR檢測在人工誘導(dǎo)蛻膜化組織(ID)以及對照組織(Vehicle)中Hmgb1的表達情況;(6)Hmgb1在原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型中的表達:免疫熒光鑒定原代細胞純度;RT-qPCR檢測dtprp的表達以鑒定誘導(dǎo)蛻膜化是否成功;檢測誘導(dǎo)誘導(dǎo)蛻膜化組以及siRNA敲低Hmgb1組dtprp,hmgb1的mRNA水平。4.宮角注射Hmgb1抑制劑甘草酸,檢測蛻膜化情況:觀察宮角注射后小鼠子宮外觀,統(tǒng)計子宮濕重。5.線粒體質(zhì)量控制檢測方法:(1)采用激光共聚焦檢測線粒體形態(tài),比較敲低Hmgb1的表達對線粒體形態(tài)學(xué)影響。細胞處理組分為5組:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。Mitotracker Red染色細胞線粒體,通過激光共聚焦觀察線粒體碎片化程度。統(tǒng)計各組碎片化程度。(2)采用流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位,評估敲低Hmgb1對線粒體功能的影響。細胞處理組分為5組:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。JC-1染色細胞,流式細胞儀檢測紅、綠熒光強度,用紅/綠比值評估線粒體膜電位是否發(fā)生變化。(3)采用酶標(biāo)儀檢測ATP生成,評估敲低Hmgb1對線粒體功能的影響:細胞處理組分為5組:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。采用酶標(biāo)儀檢測ATP生成量。(4)采用流式細胞術(shù)檢測活性氧(ROS)生成狀況,評估敲低Hmgb1對線粒體功能的影響。細胞處理組分為5組:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。DCFH-DA探針染色細胞,流式細胞儀檢測活性氧強度。6.細胞自噬的檢測:(1)體內(nèi)誘導(dǎo)蛻膜化模型,Western Blot檢測各處理組線粒體相關(guān)因子及自噬相關(guān)因子的表達;(2)體外細胞實驗,敲低Hmgb1后誘導(dǎo)蛻膜化,Western Blot、RT-qPCR檢測各處理組線粒體相關(guān)因子及自噬相關(guān)因子的表達;(3)宮角注射甘草酸與玉米油模型,Western Blot、RT-qPCR檢測各處理組線粒體相關(guān)因子及自噬相關(guān)因子的表達;透射電鏡檢測自噬小體。7.RNA-seq檢測在蛻膜化過程中受Hmgb1調(diào)控的差異基因采用轉(zhuǎn)錄組測序法對宮角注射的正常組(PBS)-A1組、誘導(dǎo)蛻膜化組(Oil+DMSO)-A2組、溶劑對照組(DMSO)-A3組、抑制組(GA+Oil+DMSO)-A4組的子宮組織材料進行轉(zhuǎn)錄組測序,分析差異表達基因,對差異基因進行功能聚類(GO分析)。8.RNA-seq測序數(shù)據(jù)分析:(1)分析在蛻膜化過程中受Hmgb1調(diào)控與線粒體功能相關(guān)的差異基因;(2)分析在蛻膜化過程中受Hmgb1調(diào)控與ER/PR應(yīng)答基因相關(guān)的差異基因;(3)分析在蛻膜化過程中受Hmgb1調(diào)控與免疫相關(guān)的差異基因。結(jié)果:1.Hmgb1對蛻膜化的影響:(1)Hmgb1在圍著床期的表達規(guī)律:IHC結(jié)果顯示:Hmgb1僅表達于D1腔上皮與腺上皮;D4天Hmgb1表達于腔上皮、腺上皮以及部分基質(zhì)細胞中;Hmgb1高表達于D5IS初級蛻膜區(qū)以及D6IS、D8IS的次級蛻膜區(qū),在D5IIS與D6IIS僅表達于腔、腺上皮。ISH結(jié)果顯示:同IHC結(jié)果一致,Hmgb1于D1僅表達于腔上皮與腺上皮,D4表達于腔、腺上皮與部分基質(zhì)細胞;Hmgb1在D5IS、D6IS、D8IS蛻膜區(qū)域高表達,D5IIS與D6IIS僅在腔上皮與腺上皮表達。Western Blot與RT-qPCR結(jié)果顯示Hmgb1在著床點高表達。(2)Hmgb1在假孕期的表達規(guī)律:IHC結(jié)果顯示:Hmgb1在PD1、PD4、PD5、PD6、PD8腔上皮與腺上皮表達,且PD5、PD6、PD8呈弱表達。Western Blot與RT-qPCR結(jié)果顯示Hmgb1在PD5、PD6、PD8弱表達。(3)Hmgb1在延遲著床模型的表達規(guī)律:IHC結(jié)果顯示,Hmgb1低表達于延遲組,高表達于激活組。(4)Hmgb1在誘導(dǎo)蛻膜化模型的表達:誘導(dǎo)蛻膜化組經(jīng)dtprp鑒定為誘導(dǎo)蛻膜化成功模型,Hmgb1在誘導(dǎo)蛻膜化組呈強陽性表達。(5)抑制Hmgb1對體內(nèi)蛻膜化的影響:宮角注射獲取人工誘導(dǎo)蛻膜化組(Oil)、GA+Oil組、PBS組以及溶劑DMSO組,結(jié)果顯示,與誘導(dǎo)蛻膜化組相比,GA+Oil組蛻膜化受到抑制。(6)敲低Hmgb1對體外誘導(dǎo)蛻膜化的影響:在原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中加入siRNA敲低Hmgb1后誘導(dǎo)蛻膜化發(fā)現(xiàn):Hmgb1敲低后蛻膜化標(biāo)志物dtprp表達下降,表明敲低Hmgb1會阻礙蛻膜化進程;細胞僅誘導(dǎo)蛻膜化后Hmgb1表達升高。2.Hmgb1調(diào)控線粒體質(zhì)量而影響蛻膜化進程:(1)Mitotracker Red染色細胞線粒體,采用激光共聚焦觀察線粒體碎片化程度發(fā)現(xiàn),與誘導(dǎo)組相比,敲低Hmgb1后誘導(dǎo)組線粒體碎片化程度增高,影響線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu);(2)流式檢測線粒體膜電位發(fā)現(xiàn):與誘導(dǎo)組相比,敲低Hmgb1后誘導(dǎo)組線粒體膜電位降低,影響線粒體發(fā)揮正常功能;(3)酶標(biāo)儀檢測ATP生成發(fā)現(xiàn):與誘導(dǎo)組相比,敲低Hmgb1后誘導(dǎo)組ATP生成減少,影響線粒體發(fā)揮正常功能;(4)流式細胞檢測ROS生成發(fā)現(xiàn):與誘導(dǎo)組相比,敲低Hmgb1后誘導(dǎo)組活性氧釋放增多,影響線粒體發(fā)揮正常功能。4.Hmgb1調(diào)控細胞自噬過程進行線粒體質(zhì)量控制,從而影響蛻膜化進程:(1)體內(nèi)誘導(dǎo)蛻膜化模型,采用Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)組線粒體相關(guān)因子Drp1、Slp2表達上調(diào),自噬相關(guān)因子Lc3b-Ⅱ表達上調(diào);(2)體外細胞實驗:與誘導(dǎo)組相比,敲低Hmgb1后誘導(dǎo)組,Western Blot檢測線粒體相關(guān)因子Slp2表達降低,自噬相關(guān)因子Lc3b-Ⅱ表達降低;RT-qPCR檢測線粒體相關(guān)因子slp2,dnm1l降低,自噬相關(guān)因子map1lc3b,atg5表達下降,sqstm1表達升高;(3)宮角注射玉米油人工誘導(dǎo)蛻膜化組(Oil)、注射GA+Oil組、注射PBS組以及注射溶劑DMSO組:Western Blot檢測線粒體相關(guān)因子Slp2,GA+Oil組較誘導(dǎo)組(Oil)蛋白水平表達下降,自噬相關(guān)因子Lc3b-Ⅱ表達下降,p62表達升高;RT-qPCR檢測線粒體相關(guān)因子slp2表達降低,自噬相關(guān)因子map1lc3b,atg5表達下降,sqstm1表達升高。(4)在誘導(dǎo)組(Oil)可觀察到自噬小體,GA+Oil組可看到空泡化線粒體存在。5.對玉米油宮角注射人工誘導(dǎo)蛻膜化Oil(A2)、GA+Oil(A4)、注射PBS(A1)以及注射溶劑DMSO(A3)的子宮組織進行RNA-seq測序,結(jié)果共獲得在蛻膜化過程中與Hmgb1相關(guān)的差異基因1505個,其中與線粒體功能和自噬相關(guān)的差異基因有32個;與轉(zhuǎn)錄調(diào)控ER/PR應(yīng)答基因的差異基因有27個;與調(diào)控免疫相關(guān)的差異基因有19個。結(jié)論:1.Hmgb1在圍著床期具有特定的時空表達特點,在胚胎著床過程中與蛻膜化相關(guān);缺乏Hmgb1會抑制小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的蛻膜化進程,從而影響妊娠結(jié)局。2.在蛻膜化過程中,Hmgb1通過調(diào)控胞質(zhì)中線粒體自噬而進行線粒體質(zhì)量控制;缺失Hmgb1則無法正常調(diào)控細胞自噬而造成線粒體損傷,線粒體無法發(fā)揮正常功能最終造成蛻膜化進程受阻。3.在蛻膜化過程中,核內(nèi)Hmgb1通過調(diào)控ER/PR應(yīng)答和免疫應(yīng)答過程相關(guān)基因從而發(fā)揮調(diào)控細胞增殖與分化功能。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R71
【部分圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文采用酶解法分離小鼠原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞，細胞純度為 99%（圖 9A）。進一步利用 siRNA 敲低 Hmgb1 的表達（圖 9B 和 9C）。在此基礎(chǔ)上，對敲低組細胞和對照組細胞進行體外誘導(dǎo)蛻膜化，結(jié)果顯示，Hmgb1 高表達于誘導(dǎo)蛻膜化組（si-Nc+E2+P4）（圖 9D）,蛻膜化標(biāo)志物 dtprp 在敲低誘導(dǎo)組（si-Hmgb1+E2+P4）中低表達。說明敲低 Hmgb1 蛻膜化過程受到阻礙（圖 9E）。通過此細胞功能實驗可知：Hmgb1 的表達會影響子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化進程，敲低 Hmgb1,蛻膜化進程將不能正常進行。

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文plantation sites; LE, luminal epithelial; GE, glandular epithelium; em, embryidual zone; S, stroma; SDZ, secondary decidual zone; em, embryo. NC, negPC, positive control; Scale bar, 200 μm

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文誤表示。柱狀圖每條柱上不同的小寫字母表示組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P < 0.05），相同字母表示組間無統(tǒng)計學(xué)差異。每組實驗重復(fù) 3-4 次。Fig.2 Western blot analysis of Hmgb1 protein expression (A and B)and real-time quantitativepolymerase chain reaction examination of endometrial Hmgb1 mRNA expression (C).Actb was used as an internal control. One-way analysis of variance was used to calculate thedifferences. The results are represented as mean ±SE. Bars labelled with different lowercase lettersindicate that the data are significantly different between groups (P < 0.05).

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10 王煒;趙小萱;古sト

本文編號：2832114