目的:本實(shí)驗(yàn)初步探討自噬對(duì)腫瘤壞死因子凋亡相關(guān)誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響,為將TRAIL應(yīng)用于宮頸癌治療提供新的策略。方法:⑴體外培養(yǎng)人宮頸癌Hela細(xì)胞株。⑵用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)不同濃度TRAIL作用及TRAIL與3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)或氯喹(chloroquine,CQ)聯(lián)合作用的Hela細(xì)胞增殖活性,倒置顯微鏡下觀察Hela細(xì)胞的形態(tài)變化。⑶免疫熒光法(immunofluorescence,IF)對(duì)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(microtubule associated protein 1 light chain3B,LC3B)、p62進(jìn)行熒光染色,并在熒光顯微鏡下觀察;用DAPI染色觀察Hela細(xì)胞凋亡。⑷用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LC3B、p62及聚ADP核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerse,PARP)蛋白的表達(dá)水平。⑸數(shù)據(jù)分析用SPSS17.0軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá),組間均數(shù)比較用方差分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:⑴TRAIL可抑制Hela細(xì)胞的增殖活性:不同濃度TRAIL處理Hela細(xì)胞48 h,Hela細(xì)胞的增殖活性隨濃度增大而下降,半數(shù)抑制率濃度為6.54 ng/m L,選擇TRAIL藥物濃度在IC50值以下,2.0 ng/m L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。⑵3-MA或CQ增強(qiáng)TRAIL對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用:TRAIL與3-MA或CQ聯(lián)合作用于Hela細(xì)胞其增殖活性與單獨(dú)使用TRAIL或3-MA或CQ組相比明顯降低,P0.05,差異有顯著意義。⑶TRAIL可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生自噬:TRAIL作用于Hela細(xì)胞,Hela細(xì)胞內(nèi)LC3聚集體增多,LC3熒光點(diǎn)及LC3Ⅱ蛋白水平升高,說明TRAIL可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成;TRAIL與CQ聯(lián)合作用于Hela細(xì)胞較單獨(dú)TRAIL或CQ作用,LC3聚集體顯著增加,LC3熒光點(diǎn)及LC3Ⅱ蛋白水平顯著升高,證實(shí)LC3聚集是由自噬活性增強(qiáng)引起的;3-MA、TRAIL與3-MA聯(lián)合作用于Hela細(xì)胞,LC3熒光點(diǎn)及LC3Ⅱ蛋白水平降低,提示3-MA可抑制自噬。TRAIL組與control組相比,p62熒光點(diǎn)及蛋白水平明顯降低;加入自噬抑制劑組(CQ、TRAIL+CQ、3-MA、TRAIL+3-MA組)p62熒光點(diǎn)及蛋白水平較TRAIL組升高。總之,TRAIL可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生自噬;3-MA、CQ可抑制細(xì)胞自噬。⑷3-MA或CQ明顯增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡:DAPI染色發(fā)現(xiàn),TRAIL與3-MA或CQ聯(lián)合作用Hela細(xì)胞的凋亡率與單獨(dú)使用TRAIL或3-MA或CQ比較明顯增高,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑸3-MA或CQ增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá):TRAIL與3-MA或CQ聯(lián)合作用于Hela細(xì)胞,cleavage-PARP的表達(dá)較TRAIL組顯著增加,P0.05差異有意義。結(jié)論:1.TRAIL可抑制Hela細(xì)胞的增殖活性,并且呈劑量依賴性。2.TRAIL在誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的同時(shí)也可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,且自噬對(duì)Hela細(xì)胞的存活起保護(hù)作用。3.抑制自噬可增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R737.33
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
常用縮寫詞中英文對(duì)照表
前言
1 材料與方法
    1.1 細(xì)胞株
    1.2 主要試劑和儀器
    1.3 主要試劑的配制
    1.4 實(shí)驗(yàn)方法
    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 TRAIL抑制Hela細(xì)胞的增殖活性
    2.2 3-MA或CQ明顯增強(qiáng)TRAIL對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用
    2.3 TRAIL誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生自噬
    2.4 3-MA或CQ明顯增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡
    2.5 3-MA或CQ增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡蛋白的表達(dá)
3 討論
4 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
在學(xué)期間參與或承擔(dān)的科研課題與研究成果
個(gè)人簡(jiǎn)歷

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本文編號(hào)：2831105