目的:HR-HPV病毒E6E7蛋白是誘發(fā)宮頸癌的主要始動因素,但僅HPV感染并不足以致癌,需要其他促癌因素的共同作用。在腫瘤中多存在剪接因子的異常表達,腫瘤的十大典型生物學行為均涉及基因的異�？勺兗艚�。那么,可變剪接是否作為E6E7的“同謀”在宮頸癌變過程中發(fā)揮作用?考慮到HR-HPV感染及異�？勺兗艚釉谀[瘤發(fā)生中的重要作用,本課題擬探究HR-HPV感染、可變剪接與宮頸癌間的關(guān)系,深化對HR-HPV致宮頸癌機制的認識并探究靶向可變剪接以治療宮頸癌的可能。內(nèi)容及方法:1)利用RNAi技術(shù)在HPV16/18陽性的宮頸癌細胞系中干擾E6E7表達并進行全基因表達譜分析及PCR驗證,探究E6E7是否調(diào)控剪接因子的表達并篩選出變化最顯著者SRSF10。2)利用Oncomine等數(shù)據(jù)庫分析剪接因子SRSF10在宮頸癌中的表達,并進行IHC驗證;構(gòu)建shSRSF10宮頸癌穩(wěn)轉(zhuǎn)株,建立裸鼠移植瘤模型,觀察SRSF10在宮頸癌中的功能。3)利用ChIP及雙熒光素酶報告基因技術(shù)驗證轉(zhuǎn)錄因子E2F1與SRSF10啟動子區(qū)的結(jié)合;干擾E2F1,利用WB技術(shù)檢測E2F1對SRSF10表達的調(diào)控,明確E6E7上調(diào)SRSF10的具體機制。4)利用TCGAspliceseq、CLIP-seq數(shù)據(jù)分析SRSF10調(diào)控的可變剪接靶基因;干擾SRSF10,利用PCR、RNA-seq及CLIP技術(shù)驗證SRSF10對靶基因可變剪接的調(diào)控。5)利用雙熒光素酶報告基因、WB、ChIP及IHC等技術(shù)證明SRSF10介導IL1RAP可變剪接對IL1β-NF-κB通路及下游免疫檢查點分子CD47的調(diào)控,探究SRSF10調(diào)控IL1RAP可變剪接促進宮頸癌進展的分子機制。結(jié)果:1)干擾E6E7后,19個核心剪接因子表達下調(diào),其中以剪接因子SRSF10下調(diào)最為顯著。2)SRSF10在宮頸癌中表達上調(diào)且與HPV感染有關(guān),干擾SRSF10可抑制宮頸癌細胞的成瘤能力。3)轉(zhuǎn)錄因子E2F1結(jié)合SRSF10啟動子區(qū),促進SRSF10的轉(zhuǎn)錄激活上調(diào)SRSF10的表達。4)SRSF10調(diào)控IL1RAP的可變剪接促進mIL1RAP的產(chǎn)生。mIL1RAP參與SRSF10的促癌作用。5)SRSF10介導的IL1RAP可變剪接通過調(diào)控IL1β-NF-κB通路上調(diào)免疫檢查點分子CD47的表達,從而抑制巨噬細胞對宮頸癌細胞的吞噬。結(jié)論:HR-HPV E6E7通過E2F1促進剪接因子SRSF10的轉(zhuǎn)錄激活,上調(diào)其表達。SRSF10介導IL1RAP可變剪接通過調(diào)控IL1β-NF-κB通路上調(diào)免疫檢查點分子CD47的表達,抑制巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬,促進宮頸癌的形成。
【學位單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，占女性惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率的第四位（圖1）。宮頸癌每年新增病例 53 萬例，其中幾乎 85%發(fā)生于不發(fā)達國家及發(fā)展中國家[2]；每年死亡病例 27萬例，不發(fā)達國家及發(fā)展中國家的死亡率是發(fā)達國家的 18 倍[3]。中美、南美、加勒比海、南非及南亞地區(qū)為宮頸癌主要高發(fā)區(qū)[4]。在我國，宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤（圖 2），其年齡標準化發(fā)病率（Age-standardized Incidence Rate，ASIR）逐漸升高[6]。據(jù)最新的流行病學數(shù)據(jù)顯示，城市及 農(nóng) 村 地 區(qū) 的 ASIR 分 別 為10.1/10 萬和 10.5/10 萬[7]。宮頸癌發(fā)病呈年輕化趨勢，45-49 歲為宮頸癌的好發(fā)年齡。宮頸癌地域差異明顯

11的趨勢[6]。據(jù)統(tǒng)計，2015 年共計 2.64 萬人死于宮頸癌[92.4/10 萬和 2.9/10 萬[8]。宮頸癌死亡的高峰年齡為 85 西部及東部地區(qū)。因此，中西部地區(qū)和農(nóng)村地區(qū)仍是我圖 2 女性高發(fā)惡性腫瘤(2015,中國)[5]Fig 2 Most common tumors of the females（2015, China）[5]

8re及非編碼長控制區(qū)（Non-coding long control region, LCR）白被認為是宮頸癌的主要致癌蛋白[13]。E6 通過泛素依賴通過與 pRb 家族成員（p107 和 p130）相互作用，競爭 p結(jié)合，使 E2F 釋放，進而導致一系列腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)1.3 宮頸癌是多因素、多階段的病理過程宮頸癌并非 HR-HPV 感染的直接結(jié)果，需要其他促素、多階段共同作用的病理過程[16]。因此，改善宮頸癌上促進宮頸癌的發(fā)生的具體機制。近期研究表明，慢性炎頸上皮癌變的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17-19]。慢性炎癥是腫環(huán)境的炎癥狀態(tài)可破壞機體免疫系統(tǒng)，阻止免疫系統(tǒng)對[21圖 3 E6E7 為 HPV 的主要致癌蛋白[14]Fig 3 E6E7 are the major oncoproteins of HPV[14]

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