背景和目的乙型肝炎是一種由乙型肝炎病毒感染所引起的傳染性疾病,我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)地區(qū)。乙型肝炎病毒能夠穿過(guò)血睪屏障,并能進(jìn)入精子細(xì)胞核中整合在染色質(zhì)上,因此病毒可以通過(guò)生殖細(xì)胞進(jìn)行垂直傳播。HBV感染伴隨著大量表觀遺傳學(xué)的修飾改變,但其影響精子質(zhì)量的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。隨著輔助生殖技術(shù)的進(jìn)步,卵子受精時(shí)對(duì)精子質(zhì)量的要求大大降低,但父源HBV病毒是否通過(guò)精子能影響胚胎的發(fā)育以及其影響機(jī)制,有待進(jìn)一步闡明。研究HBV對(duì)人精子功能影響是乙肝病毒感染分子生物學(xué)和生殖醫(yī)學(xué)的交叉領(lǐng)域,研究精子組蛋白表觀遺傳修飾對(duì)精子及對(duì)胚胎發(fā)育的影響,有助進(jìn)一步明確HBV導(dǎo)致男性生育力改變的原因。也為研發(fā)提高男性生育力的治療及阻斷乙肝病毒垂直傳播提供理論依據(jù)。研究方法回顧性分析2014年1月至2016年1月至我院生殖中心行輔助生殖技術(shù)治療(IVF/ICSI)的配偶2359對(duì)。按是否感染HBV進(jìn)行分組分析男方的精液質(zhì)量及子代胚胎的發(fā)育情況;收集HBV患者精液樣本,利用表達(dá)譜芯片初步探討HBV感染者對(duì)男性精子的影響,篩選差異表達(dá)基因進(jìn)行分析;篩選出差異表達(dá)基因H3K9me3,用免疫共沉淀技術(shù)篩選與H3K9me3及HBx在精子中相關(guān)的蛋白,采用RTqRCP、western-blot驗(yàn)證芯片分析結(jié)果;采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建Hbx穩(wěn)定表達(dá)鼠精原細(xì)胞,用細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)、小RNA干擾表達(dá)等多個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)HBx蛋白影響精細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行探討;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討HBx蛋白對(duì)胚胎的發(fā)育的影響。采集小鼠卵及精子進(jìn)行轉(zhuǎn)染及其甲基化水平進(jìn)行分析,觀測(cè)其表達(dá)及對(duì)胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果乙肝表面抗原陽(yáng)性的男性患者精子濃度、精子總數(shù)、PR率、精子存活率較低,畸型精子率更高;父系乙肝病毒感染影響ICSI結(jié)局、正常受精率、優(yōu)胚率低于抗原陰性組;乙肝病毒高拷貝數(shù)使精子質(zhì)量和優(yōu)胚率下降;在HBV患者精子中存在多種差異表達(dá)基因,包括H3K9me3、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(Suv39H1)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、HBx蛋白。其功能涉及組蛋白修飾、精子發(fā)生、細(xì)胞分化、染色質(zhì)形成;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Hbx在精子中能引起Suv39H1的下調(diào),從而引起組蛋白H3K9me3的下降、導(dǎo)致精子組蛋白替換異常、精子DNA損傷、精原細(xì)胞細(xì)胞周期停滯、凋亡增加。HBx的表達(dá)可能受UBP1的調(diào)控,HBx能與E2F5共同作用抑制Suv39H1的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染HBx后精子高表達(dá)H19、KCNQ1OT1,低表達(dá)IGF2。在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中,小鼠精子轉(zhuǎn)染HBx后未見對(duì)植入前胚胎的發(fā)育產(chǎn)生影響。結(jié)論HBV感染患者能在精原細(xì)胞表達(dá)HBx蛋白,通過(guò)HBx蛋白使精子組蛋白替換異常、精子DNA損傷、細(xì)胞分裂減慢、凋亡增加,精子的數(shù)量和質(zhì)量下降。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中HBx能影響部分印跡基因控制區(qū)域甲基化水平。
【學(xué)位單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R714.8;R512.62
【部分圖文】：

圖 2-1 樣品相關(guān)性聚類分析熱圖2.2 散點(diǎn)圖特征分析本研究中表達(dá)差異基因數(shù)據(jù)，將其數(shù)值轉(zhuǎn)化為 log 以 2 為底的對(duì)數(shù)后，在一個(gè)二維直角坐標(biāo)系平面中，繪制成圖 2-2 所示的散點(diǎn)圖。圖中可見，每一個(gè)點(diǎn)代表芯片上的某一個(gè)基因探針的表達(dá)量。該點(diǎn)在散點(diǎn)圖中的分布位置由其 X 軸坐標(biāo)和 Y軸坐標(biāo)確定：X 軸代表該基因在乙肝陽(yáng)性組中換算后的表達(dá)量。Y 軸代表該基因在非乙肝對(duì)照組中換算以后的表達(dá)量。紅色點(diǎn)表示 1.5 倍上調(diào)基因共 1239 個(gè)，綠色點(diǎn)表示 1.5 倍下調(diào)基因共 1161 個(gè)，無(wú)差異基因 29581 個(gè)。散點(diǎn)圖的相關(guān)系數(shù)為 0.9723，相關(guān)性較好。

圖 2-2 差異基因散點(diǎn)圖征分析于反映具備差異表達(dá)的基因的數(shù)目及其分布情況。圖 2)值，即由 t-檢驗(yàn)計(jì)算所得的 P-value 值的以 10 為底的對(duì)數(shù)2 (Fold Change)，即兩組樣本間的差異倍數(shù)的以 2 為底的表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)。紅色區(qū)域代表 P-value <0.05，F(xiàn)old基因，即表達(dá)量顯著差異共 214 個(gè)，綠色區(qū)域代表 P-val0 的有差異的下調(diào)基因，即表達(dá)量顯著差異共 86 個(gè)，無(wú)681 個(gè)。

圖 2-3 差異基因的火山圖因染色體分布一步了解差異基因的功能，采用 genome browser 和 RNAplex，找染色體的位置，統(tǒng)計(jì)所有差異基因在染色體的分布位點(diǎn)，繪制標(biāo)為基因數(shù)目，橫坐標(biāo)為染色體位置，深色的柱子為上調(diào)基因的基因。圖中可見，顯著上調(diào)的基因主要分布在 1 號(hào)、3 號(hào)、5體上，顯著下調(diào)的基因主要分布在 2 號(hào)、11 號(hào)、22 號(hào)染色體上最多顯著差異基因。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號(hào)：2827444