子宮頸癌是目前女性最常見的婦科惡性腫瘤之一,根據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO 2018年發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計報告推算,2018年全球女性子宮頸癌新發(fā)病例數(shù)為569847人,死亡病例數(shù)為31 1365人,發(fā)病比例13.1%和死亡比例6.9%,在女性腫瘤中均排在第四位,發(fā)展中國家發(fā)病率及死亡率均顯著高于發(fā)達國家。2015年中國人口癌癥統(tǒng)計學報告中發(fā)現(xiàn),中國女性人群的子宮頸癌發(fā)病率以及死亡率從2000年至2014年呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。高危型人乳頭瘤病毒HPV持續(xù)性感染是目前公認的宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要危險因素,但這個過程緩慢,常持續(xù)數(shù)十年,且僅有極少數(shù)的HPV感染患者進展為宮頸癌,說明除HPV持續(xù)感染外,多個其它因素參與了致癌過程。因此,深入探究宮頸癌致癌機制,對宮頸癌的精準篩查及治療具有重要的意義。microRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類來源于內(nèi)源性染色體上的非編碼RNA,平均長度約為22個核苷酸。通過與基因mRNA的非翻譯區(qū)(3'-UTR)序列互補,引起目的RNA降解或者翻譯抑制,從而對基因進行轉錄后的表達調(diào)控。根據(jù)其所調(diào)控的靶基因的功能不同,miRNA可扮演原癌基因或抑癌基因角色,在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉移及耐藥等過程中發(fā)揮重要作用。血管生成(angiogenesis)是指在原有的血管上形成新生的血管,正常情況下血管生成是受促血管生成因子和血管抑制因子的協(xié)同調(diào)控。然而腫瘤形成的過程中血管生成失去了正常的調(diào)控,血管生成異常增多。腫瘤血管生長的過程包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細胞遷移、細胞增殖、內(nèi)皮細胞形成新的基底膜等步驟。新生血管為腫瘤細胞提供源源不斷的營養(yǎng)物質(zhì),促進腫瘤迅速生長與轉移,是惡性腫瘤侵襲轉移及耐藥的重要機制。miR-9在膠質(zhì)瘤、頭頸部鱗癌、乳腺癌中表達上調(diào),而在大腸癌、結腸癌、胃癌等中則表達下調(diào),惡性乳腺癌患者的初期,其miR-9水平升高,可促進腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉化(EMT),并且miR-9可增強血管的生長,從而增加腫瘤的血液供應,促進腫瘤的生長與侵襲。因此本課題主要致力于研究miR-9在子宮頸癌發(fā)生發(fā)展、血管形成及放療耐受中作用機制,研究內(nèi)容主要分為三個部分:第一部分:miR-9-5p在宮頸鱗癌中的表達及其臨床意義第二部分:miR-9-5p對宮頸癌細胞增殖轉移的影響及其作用機制第三部分:miR-9-5p對宮頸癌放療敏感性的影響及作用機制第一部分:miR-9-5p在宮頸鱗癌中的表達及其臨床意義研究目的:miRNA已被發(fā)現(xiàn)在不同類型的癌癥中作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮重要甚至決定性作用。淋巴結轉移作為宮頸癌的主要轉移途徑,其機制有待深入研究。本研究主要目的是篩選與宮頸癌淋巴結轉移相關的特異性miRNA,并明確其與臨床病理和預后的關系。材料和方法:使用腫瘤基因組圖譜計劃(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫分析miRNA在宮頸癌淋巴結轉移陽性與淋巴結轉移陰性組織中的表達差異。進一步驗證miR-9-5p在22例宮頸癌淋巴結轉移陽性和22例宮頸癌淋巴結轉移陰性患者癌組織中的表達情況,分析miR-9-5p表達差異與宮頸癌患者臨床病理特征之間的關系。研究結果:TCGA數(shù)據(jù)分析顯示miR-9-5p在宮頸癌淋巴結轉移陽性患者中的表達明顯高于淋巴結轉移陰性的患者。qRT-PCR(quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction)結果表明miR-9-5p在宮頸癌淋巴結轉移陽性的患者中mRNA水平表達明顯高于未轉移患者。TCGA數(shù)據(jù)庫中患者生存分析提示,miR-9-5p表達增高患者與表達相對低患者其總生存期未見明顯改變。在22例宮頸癌淋巴結轉移陽性患者中miR-9-5p的表達明顯高于淋巴結未轉移患者,分析44例宮頸癌患者的臨床病理資料發(fā)現(xiàn),miR-9-5p在mRNA水平表達的差異僅與淋巴結轉移相關,在宮頸癌患者的年齡、分期、分化、腫瘤大小和有無脈管浸潤的表達上均無明顯差異。研究結論:MiR-9-5p在宮頸癌淋巴結轉移陽性患者癌組織中的表達高于未發(fā)生淋巴結轉移的患者。第二部分:miR-9-5p對宮頸癌細胞增殖轉移的影響及其作用機制研究目的:以往研究表明,miR-9在膠質(zhì)瘤、頭頸部鱗癌、乳腺癌中表達升高,扮演癌基因的角色;在惡性乳腺癌患者的初期,其miR-9水平升高,可促進腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),促進腫瘤的生長與侵襲,根據(jù)第一部分的結果,我們推測miR-9-5p在宮頸癌中也是一個癌基因,此部分研究的目的是觀察miR-9-5p對宮頸癌細胞增殖侵襲遷移能力的影響,對 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)細胞血管形成能力的影響,同時鑒定miR-9-5p下游靶基因并探索其可能的作用機制。材料和方法:選取宮頸癌細胞系SiHa,通過轉染miR-9-5p的mimics或inhibitor來上調(diào)或下調(diào)miR-9-5p的表達,體外利用CCK-8法測定生長曲線,檢測細胞增殖能力;利用Transwell小室實驗計數(shù)穿過的細胞數(shù)目檢測細胞侵襲和遷移能力的改變。利用血管形成實驗檢測miR-9-5p對HUVEC細胞血管形成能力的影響。利用Western blot(WB)檢測miR-9-5p對宮頸癌增殖相關蛋白、血管形成相關蛋白及上皮間質(zhì)轉化EMT相關分子的影響。體內(nèi)實驗采用裸鼠皮下成瘤的方法,比較成瘤能力的差異。通過預測軟件Targetscan和miRanda篩選出miR-9-5p 下游靶基因SOCS5。免疫組化檢測宮頸癌組織和正常宮頸組織中SOCS5表達差異,比較其與miR-9-5p表達的相關性。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CSOCS5是否可以作為miR-9-5p的直接下游靶點。采用Rescue實驗檢測SOCS5的過表達是否可以逆轉miR-9-5p對宮頸癌細胞的促進作用。Western blot檢測上皮間質(zhì)轉化相關分子及血管形成相關分子的變化以確認miR-9-5p與SOCS5的相互作用對下游通路和細胞惡性行為的影響。研究結果:在體外實驗中,與對照組相比,轉染miR-9-5p mimics組的宮頸癌細胞SiHa的增殖能力增強,其侵襲和遷移能力也明顯增強,轉染miR-9-5p inhibitor組的SiHa細胞增殖能力減弱,侵襲和遷移能力減弱。以轉染miR-9-5p mimics組的細胞上清與HUVEC細胞共培養(yǎng),HUVEC細胞形成的血管數(shù)量比對照組增加,血管結構更加成熟。Western blot實驗結果顯示轉染miR-9-5p mimics組中,EMT相關分子中上皮性標記物E-cadherin的表達明顯降低,間皮性標記物N-cadherin、Snail、Vimentin 表達均升高,增殖相關蛋白 p-mTOR(phosphorylated-mammalian target of rapamycin)的表達升高,血管生成相關因子p-VEGFR2和VEGFA 均升高。在轉染 miR-9-5p inhibitor 組中,E-cadherin、N-cadherin 等 EMT相關分子、增殖和血管生成相關分子的變化趨勢與mimics組相反。在體內(nèi)實驗中,miR-9-5p過表達組裸鼠成瘤能力增加。TargetScan 和 miRanda 的預測結果顯示miR-9-5p 存在與 SOCS5 mRNA 3-UTR(un-translationla region)的結合位點。與正常宮頸組織相比,在宮頸癌組織中SOCS5的表達低,與miR-9-5p的表達呈負相關。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y果顯示miR-9-5p mimics顯著降低野生型組(wild type,wt)細胞的熒光強度,而沒有改變突變組(mutant type,mut)細胞的熒光強度。Rescue實驗結果顯示,miR-9-5p上調(diào)細胞穩(wěn)定轉染SOCS5后,通過血管形成實驗分析表明,SOCS5過表達組能夠抑制miR-9-5p促進血管生成的作用。Western blot顯示在miR-9-5p穩(wěn)定轉染細胞中轉染SOCS5后,會逆轉miR-9-5p對EMT及血管生成相關因子的調(diào)節(jié)作用,E-cadherin的表達量上升,血管形成相關分子p-VEGFR2、VEGFA表達顯著減少,相關通路p-ERK表達量也相對減少。研究結論:MiR-9-5p通過靶向抑制SOCS5的表達促進宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力,促進HUVECs細胞的血管形成能力。第三部分:miR-9-5p對宮頸癌放療敏感性的影響及作用機制研究目的:放療是宮頸癌治療的最有效手段之一,miRNA在放療耐受及敏感中起重要作用。本研究目的在于探究miR-9-5p對宮頸癌放療敏感性的影響,進一步探索其相關的分子機制,為改善宮頸癌放療效果提供新思路和靶點。材料和方法:采用OGy、4Gy的γ射線照射轉染miR-9-5p mimics的SiHa細胞,將其培養(yǎng)基上清與HUVECs細胞共培養(yǎng),分析HUVECs細胞的血管形成能力的改變。轉染了 miR-9-5p mimics的SiHa細胞轉染GFP-LC3慢病毒,在OGy和4Gy的γ射線照射下觀察自噬小體的數(shù)量,Western blot檢測放療后各組細胞血管形成相關蛋白及自噬相關蛋白的表達量改變。研究結果:在接受4Gy劑量γ射線的照射后,觀察到miR-9-5p mimics顯著抑制放射線對宮頸癌細胞的殺傷作用。放療后,NC組和mimics組SiHa細胞培養(yǎng)基與HUVECs細胞共培養(yǎng)后,其血管生成數(shù)量都明顯減少,轉染miR-9-5p mimics組的細胞血管生成數(shù)量下降幅度比NC組小。放療前轉染miR-9-5p mimics組的SiHa細胞自噬小體數(shù)量比NC組少,放療后,兩組細胞的自噬小體數(shù)量均有所增加,mimics組的SiHa細胞自噬小體數(shù)量增加幅度比NC組小。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)放療后自噬相關蛋白LC3表達量增高,p62、p-ULK表達量降低,血管形成相關蛋白p-VEGFR2、p-ERK、VEGFA表達量降低,但mimcs組細胞的表達量比NC組變化幅度明顯減少。研究結論:MiR-9-5p通過增加血管形成及減少自噬發(fā)生引起宮頸癌細胞的放療抵抗。本研究創(chuàng)新性:1.首次通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫,闡明miR-9-5p在淋巴結轉移陽性子宮頸癌中特異性高表達。2.完整的體內(nèi)體外實驗證實miR-9-5p在子宮頸癌發(fā)生發(fā)展及血管形成中起重要作用。3.首次發(fā)現(xiàn)SOCS5是miR-9-5p的直接下游靶點。4.首次闡明miR-9-5p可通過降低自噬的發(fā)生影響子宮頸癌的放療敏感性。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

邋＾邋ｂｙ邋ｐｅｒｍｉｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．逡逑圖１逡逑微�。遥危铃澹ǎ恚椋悖颍铮遥危�，ｍｉＲＮＡ）是長度為２０－２２個核苷酸大小的內(nèi)源性的逡逑短非編碼單鏈ＲＮＡ，在ｍＲＮＡ的３＇端非編碼（３‘－ＵＴＲ）序列區(qū)存在其靶向結逡逑合位點，它可以通過與靶位點的特異性互補結合［８］，降解ｍＲＮＡ或抑制ｍＲＮＡ逡逑翻譯達到調(diào)節(jié)基因表達，從而發(fā)揮生物學功能的作用。近來的研宄表明，ｍｉＲＮＡ逡逑的異常表達在腫瘤細胞的增殖、遷移及惡性進展中發(fā)揮著關鍵性作用，ｍｉＲＮＡ逡逑作為癌癥預測、診斷和預后的生物標志物的重要作用也得到了廣泛的關注［９］。逡逑此外，越來越多研宄表明，ｍｉＲＮＡ在放療抵抗中也起著重要的作用，如Ｗａｎｇ［１０］逡逑等人發(fā)現(xiàn)ｍｉＲ－１０６ｂ的表達在放療敏感組的腫瘤組織中較放療抵抗組顯著降低。逡逑本研究的目的在于篩選與子宮頸癌淋巴結轉移相關的特異性ｍｉＲＮＡ，并探逡逑宄其在子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用及對子宮頸癌放療敏感性的影響，為改善逡逑子宮頸癌放療效果、提高預后提供新思路和靶點。逡逑２０逡逑

圖１ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫中宮頸癌患者ｍｉＲＮＡ的表達情況逡逑１Ａ熱圖顯示盆腔淋巴結陽性和陰性的宮頸癌中差異表達ｍｉＲＮＡ，紅色代表上調(diào)，逡逑綠色代表下調(diào)。逡逑１Ｂ邋ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫中盆腔淋巴結陽性（ｎ＝５２）和盆腔淋巴結陰性（ｎ＝１０７）的宮頸逡逑癌患者組織中ｔｎｉＲ－９－５ｐ的相對表達量。＊＊ｐ＜０．邋０１逡逑５５逡逑

圖２我院盆腔淋巴結陽性（ｎ＝２２）和盆腔淋巴結陰性（ｎ＝２２）的宮頸癌患者逡逑ｍｉＲ－９－５ｐ邋的相對表達量

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本文編號：2826979