孕激素M受體(progesterone receptor mitochondrial,PR-M)是近些年發(fā)現(xiàn)的存在于線粒體外膜的一種新型孕激素受體,其獨(dú)特線粒體定位特征決定其功能,研究發(fā)現(xiàn)孕激素可以通過(guò)孕激素M受體上調(diào)線粒體膜電位促進(jìn)子宮平滑肌細(xì)胞的異常增殖。我們前期研究發(fā)現(xiàn)孕激素M受體在子宮平滑肌瘤與正常瘤旁組織相比,肌瘤組織中孕激素M受體明顯高表達(dá)。通過(guò)劑量依賴(lài)的形式誘導(dǎo)原代培養(yǎng)和永生化子宮平滑肌細(xì)胞線粒體膜電位的增加,證明PR-M受體使細(xì)胞能量代謝增加、增值的非基因組作用。但具體作用機(jī)制尚未完全明確~([1])。本研究提出的假說(shuō)是:孕激素通過(guò)PR-M上調(diào)促凋亡蛋白Caspase3及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2,促進(jìn)肌瘤細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡,從而參與子宮平滑肌瘤的發(fā)生發(fā)展,這種作用可以被孕激素受體拮抗劑所抑制。子宮肌瘤是女性生殖道腫瘤中發(fā)生的最常見(jiàn)的類(lèi)型,并從單一的肌層平滑肌細(xì)胞克隆性增殖的發(fā)展,最初由細(xì)胞的遺傳變化引起的。在復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,如激素、生長(zhǎng)因子等因素的改變,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β),(WNT)/β-連環(huán)蛋白,視黃酸(RA)為子宮肌瘤的發(fā)展的重要作用。此外,這些信號(hào)因子可能通過(guò)共同的因素調(diào)節(jié),如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白kinase B(也稱(chēng)為Akt)的多個(gè)途徑。增進(jìn)腫瘤成長(zhǎng)的首要原因包含遺傳、激素、免疫和環(huán)境等原因。目前,除了外科手術(shù)如子宮切除術(shù)、子宮肌瘤剔除術(shù)、子宮動(dòng)脈栓塞(UAE)和磁共振成像引導(dǎo)聚焦超聲手術(shù)(MRgFUS),子宮肌瘤聚焦在緩解癥狀,減慢或阻止腫瘤發(fā)展的藥物的策略。治療三類(lèi)主要用于減輕癥狀,抑制肌瘤細(xì)胞增殖,即非甾體類(lèi)抗炎藥(NSAIDs)、促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRHa)和拮抗孕激素活性合成類(lèi)固醇,包括米非司酮和所有。作為一種治療策略,外科手術(shù)與手術(shù)死亡率和發(fā)病率有關(guān),藥物治療也因其副作用而受到限制。促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑可以減輕出血和大量相關(guān)的癥狀,但也可能造成重大的更年期的副作用。米非司酮(Mifepristone,MIF)被稱(chēng)為婦科藥物的中流砥柱。作為孕激素拮抗劑和其他激素治療改變雌激素和孕激素的生產(chǎn)或功能可能會(huì)影響生育能力。MIF可縮小肌瘤體積,安全、有效、經(jīng)濟(jì)的子宮肌瘤的術(shù)前輔助藥物。通過(guò)手術(shù)中收集患者子宮平滑肌瘤手術(shù)標(biāo)本提煉原代培養(yǎng)的細(xì)胞作為基礎(chǔ),使用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行平滑肌細(xì)胞鑒定,使用免疫蛋白印跡法作用于原代培養(yǎng)細(xì)胞株篩選表達(dá)孕激素M受體陽(yáng)性并孕激素A/B陰性的細(xì)胞株,使用MIF干預(yù)在不同時(shí)間、不同濃度梯度的濃度后,通過(guò)使用MTT比色法與流式細(xì)胞法檢測(cè)陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組組原代培養(yǎng)肌瘤增殖與凋亡的相關(guān)研究。使用Western blot檢測(cè)Caspase3和Bcl-2的表達(dá)水平。探討與對(duì)于指導(dǎo)臨床孕激素的合理應(yīng)用有重要意義,同時(shí)為肌瘤的預(yù)防和治療提供理論依據(jù),甚至開(kāi)辟新的治療思路,具有廣闊的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)應(yīng)用前景。材料與方法1研究對(duì)象于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科住院病人中隨機(jī)選擇2016年8月至2017年1月中因單純子宮肌瘤行開(kāi)腹子宮肌瘤挖除術(shù)的患者10例,年齡32~47歲,平均(41±3.36)歲。術(shù)前至少6個(gè)月內(nèi)未使用類(lèi)固醇激素,同時(shí)沒(méi)有合并性激素相關(guān)疾病。標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí),手術(shù)中肌瘤細(xì)胞的采集均經(jīng)患者知情同意,并通過(guò)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。術(shù)中無(wú)菌條件下切除2-3塊1立方厘米的平滑肌瘤組織,放入4℃含雙抗的DMEM試管內(nèi),置入冷藏箱到細(xì)胞間處理,用無(wú)菌培養(yǎng)皿浸泡于PBS液3-5min,使用高壓滅菌眼科剪將肌瘤組織剪碎。2試驗(yàn)方法(1)培養(yǎng)皿中細(xì)胞培養(yǎng)24h貼壁后進(jìn)行第一次換液,以后2-3天左右進(jìn)行一次換液,當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞融合后用配好的試劑胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。利用顯微鏡高倍鏡下觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞形態(tài)。并經(jīng)免疫組化確定子宮平滑肌瘤細(xì)胞。(2)首先使用蛋白免疫印跡法分別測(cè)出高表達(dá)孕激素受體M、孕激素受體A和孕激素受體B的的細(xì)胞株,從中篩選出PR-M陽(yáng)性細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)組,PR-M(-)陰性細(xì)胞株作為對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照T47D乳腺癌細(xì)胞株是同時(shí)表達(dá)孕激素受體M、A、B細(xì)胞特異性抗體。(3)實(shí)驗(yàn)分為高濃度組、中濃度組、低濃度組、對(duì)照組,其中孕激素受體拮抗劑(MIF)濃度分別為10~(-4),10~(-5),10~(-6)mol/L,空白對(duì)照。處理時(shí),對(duì)照組加入相同劑量的培養(yǎng)基。(4)通過(guò)MTT法分別檢測(cè)孕激素受體M陽(yáng)性組與陰性組高濃度組、中濃度組、低濃度組和空白組細(xì)胞增殖抑制率,每孔90μl,每組6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后,按上述分組加藥處理,培養(yǎng)48小時(shí)后在96孔板內(nèi)加入20μl混合液,在450nm酶標(biāo)儀下測(cè)吸光度,重復(fù)三次。增殖抑制率=(對(duì)照組OD450nm-實(shí)驗(yàn)組OD450nm)/(對(duì)照組OD450nm-空白組OD450nm)×100%。(5)通過(guò)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的子宮肌瘤細(xì)胞,在6孔板內(nèi)以1.0×10~5/孔培養(yǎng),根據(jù)高、中、低濃度組和對(duì)照組加入不同濃度孕激素受體拮抗劑,培養(yǎng)48h后,收集細(xì)胞于15ml的離心管,加入4℃預(yù)冷的PBS緩沖液。將離心管置于離心機(jī)內(nèi),設(shè)置轉(zhuǎn)速為800rpm,離心5min,取出后小心吸去上清液,加入100μl的Binding Buffer重懸細(xì)胞,1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(6)Western blot檢測(cè)按照MIF濃度分為高、中、低濃度組和對(duì)照組干預(yù)后,孕激素M受體陽(yáng)性組隨著MIF濃度增加凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)逐漸降低,凋亡促進(jìn)蛋白Caspase3的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。其中與對(duì)照蛋白表達(dá)量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果1.實(shí)驗(yàn)為了增加原代細(xì)胞培養(yǎng)成功率及細(xì)胞數(shù)量,通過(guò)縮短標(biāo)本運(yùn)輸時(shí)間和及時(shí)清洗肌瘤細(xì)胞,成功建立了9例子宮肌瘤體外細(xì)胞模型。倒置相差顯微鏡細(xì)胞形態(tài)觀察:細(xì)胞接種培養(yǎng)1天后,觀察貼壁狀況,隨后肌瘤細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則生長(zhǎng)。7天左右細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰,并出現(xiàn)層疊排列及典型的“峰-谷”,通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)確定該細(xì)胞是子宮平滑肌瘤細(xì)胞。(圖1—2)。2.蛋白免疫印跡法于子宮肌瘤細(xì)胞中選出PR-M陽(yáng)性細(xì)胞株(PR-M(+)/PR-A/B(-))作為實(shí)驗(yàn)組,PR-M(-)陰性細(xì)胞株(PR-M(-)/PR-A/B(+))作為對(duì)照組。3.MIF作用于兩組細(xì)胞干擾48h后,PR-M陽(yáng)性高濃度組、中濃度組、低濃度組和空白組細(xì)胞增殖抑制率分別為(29.28±3.04)%、(22.71±3.46)%、(9.32±2.27)%和(3.16±0.53)%,各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。PR-M陰性中高濃度組、中濃度組、低濃度組和空白組細(xì)胞增殖抑制率分別為(38.33±3.47)%、(33.42±4.15)%、(14.44±2.01)%和(4.14±0.65)%,各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。PR-M陽(yáng)性細(xì)胞增值抑制率小于PR-M陰性細(xì)胞增值抑制率,相同濃度組之間兩兩比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.MIF作用于兩組細(xì)胞干擾48h后,PR-M陽(yáng)性高濃度組、中濃度組、低濃度組和空白組細(xì)胞凋亡率分別為(44.63±4.69)%、(35.15±5.02)%、(18.74±2.45)%和(6.31±0.84)%,各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。PR-M陰性中高濃度組、中濃度組、低濃度組和空白組細(xì)胞凋亡率分別為(63.44±6.84)%、(51.37±6.45)%、(25.61±3.14)%和(7.73±1.04)%,各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。當(dāng)MIF中濃度1×10~(-6)mol/L,PR-M陽(yáng)性細(xì)胞凋亡率小于PR-M陰性細(xì)胞凋亡率,相同濃度組之間兩兩比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.PR-M陽(yáng)性組各組間Caspase3和Bcl-2蛋白表達(dá)量結(jié)果顯示,促凋亡蛋白Caspase3表達(dá)量隨著MIF濃度增高,蛋白表達(dá)量逐漸增大。抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量隨著MIF作用濃度的增高,蛋白表達(dá)量逐漸降低。其中不同濃度各組間蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.子宮肌瘤的生長(zhǎng)可能通過(guò)PR-M受體抑制細(xì)胞凋亡,起到促進(jìn)細(xì)胞增值,而這種作用可能被孕激素受體抑制劑所抑制。2.PR-M通過(guò)調(diào)節(jié)增殖與凋亡參與子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展,其作用機(jī)制可能與上調(diào)促凋亡蛋白Caspase3及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)相關(guān)。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R737.33
【部分圖文】：

3 結(jié)果3.1 子宮肌瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果及鑒定本實(shí)驗(yàn)通過(guò)縮短手術(shù)標(biāo)本運(yùn)送實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間及消化之前的清洗處理，提高細(xì)胞提取率和細(xì)胞純度及細(xì)胞數(shù)量，成功建立了 9 例子宮肌瘤體外細(xì)胞模型。倒置相差顯微鏡細(xì)胞形態(tài)觀察: 細(xì)胞接種 24 小時(shí)即可貼壁，隨后細(xì)胞逐漸增多、變長(zhǎng)。生長(zhǎng)良好的子宮肌瘤細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或不規(guī)則，7 天左右細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰，并出現(xiàn)層疊排列及典型的“峰－谷”，通過(guò)免疫組化鑒定為子宮肌瘤細(xì)胞，平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-actin）陽(yáng)性反應(yīng)（見(jiàn)圖 1）。

3.3 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為高濃度組、中濃度組、低濃度組、對(duì)照組，其中孕激素受體拮抗劑（MIF）濃度分別為 10-4,10-5,10-6mol/L,空白對(duì)照。處理時(shí)，對(duì)照組加入相同劑量的培養(yǎng)基。3.4 體外培養(yǎng)子宮肌瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制MTT 法通過(guò)細(xì)胞 OD 值得檢測(cè)，生長(zhǎng)曲線經(jīng)過(guò)潛伏期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，快速生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò) 1 周生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期。從而繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。呈“S”形狀，見(jiàn)圖 3

3.3 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為高濃度組、中濃度組、低濃度組、對(duì)照組，其中孕激素受體拮劑（MIF）濃度分別為 10-4,10-5,10-6mol/L,空白對(duì)照。處理時(shí)，對(duì)照組加入相劑量的培養(yǎng)基。3.4 體外培養(yǎng)子宮肌瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制MTT 法通過(guò)細(xì)胞 OD 值得檢測(cè)，生長(zhǎng)曲線經(jīng)過(guò)潛伏期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，快速長(zhǎng)，經(jīng)過(guò) 1 周生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期。從而繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。呈“S”形狀，見(jiàn)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 韓虹娟;李冬華;錢(qián)睿亞;許昕;黃玉華;倪婧;張武芳;耿建國(guó);;人子宮肌瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的比較研究[J];中國(guó)婦幼保健;2014年22期

2 封全靈;劉弘揚(yáng);;子宮平滑肌瘤組織中孕激素受體和porin mRNA的表達(dá)[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年01期

3 石巖蓉;朱穎軍;林琬君;李洋;王悅冰;;表皮生長(zhǎng)因子對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的活化作用[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展;2013年11期

4 封全靈;劉弘揚(yáng);;孕激素受體和線粒體porin蛋白在子宮肌瘤組織中的表達(dá)[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展;2013年11期

5 倪一青;孔娜;韓素萍;;孕激素對(duì)體外培養(yǎng)子宮肌瘤細(xì)胞bcl-2基因表達(dá)的影響[J];蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年06期

6 徐青;仇黎麗;徐昌芬;羅莉;朱利群;;子宮平滑肌瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2007年09期

7 周梅,付生軍;米非司酮對(duì)離體子宮肌瘤細(xì)胞PR、PCNA、Bcl-2表達(dá)的影響[J];中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志;2004年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 封全靈;PR-M對(duì)子宮平滑肌細(xì)胞線粒體膜電位作用的研究[D];鄭州大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 熊禎禎;孕激素受體抑制劑RU-486對(duì)PR-M陽(yáng)性原代子宮平滑肌瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響[D];鄭州大學(xué);2017年

2 馬艷鴿;siRNA靶向沉默COX-2對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥在位、異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞VEGF、MMP-9表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響[D];鄭州大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2822032