絨毛膜癌簡稱絨癌(Choriocarcinoma),是一類滋養(yǎng)細胞的惡性腫瘤。近些年,化療藥物的應(yīng)用極大提高了患者的存活率,但由于傳統(tǒng)化療藥物嚴重的毒副作用限制了藥物療效和臨床應(yīng)用。二氫楊梅素(dihydromyricetin,DMY)是提取自葡萄科植物藤茶的一種黃酮類化合物,已有學(xué)者報道DMY能夠抑制胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌等腫瘤細胞的生長。但在絨癌中的作用尚未有文獻報道。本研究以人絨癌JAR細胞為研究對象,旨在說明DMY聯(lián)合VP16對絨癌JAR細胞增殖和凋亡的影響,并初步探索DMY聯(lián)合VP16通過抑制JAR細胞中NF-κB的核轉(zhuǎn)位過程而發(fā)揮作用。為DMY聯(lián)合VP16在絨癌中的臨床治療提供理論依據(jù)。第一部分二氫楊梅素聯(lián)合依托泊苷對絨癌JAR細胞抑制作用的研究目的:探討二氫楊梅素(dihydromyricetin,DMY)聯(lián)合依托泊苷(etoposide,VP16)對絨癌JAR細胞的抑制作用及其相關(guān)的機制。方法:1.利用噻唑藍(MTT)法檢測空白對照組、DMY組、VP16組以及DMY與VP16聯(lián)合組(DMY+VP16)各自絨癌JAR細胞增殖情況。2.利用臺盼藍拒染實驗觀察空白對照組、DMY組、VP16組以及DMY與VP16聯(lián)合組(DMY+VP16)中被藍染的死亡JAR細胞的數(shù)量和形態(tài)。3.利用流式細胞術(shù)Annexin-FITC/PI雙染檢測分析空白對照組、DMY組、VP16組以及DMY與VP16聯(lián)合組(DMY+VP16)絨癌JAR細胞的凋亡率4.以正常肝臟HL7702細胞作為絨癌JAR細胞的正常對照細胞株,兩株細胞同時設(shè)空白對照組、DMY組、VP16組以及DMY與VP16聯(lián)合組(DMY+VP16),利用克隆形成實驗檢測各組細胞生存能力,觀察藥物的毒性作用。5.利用蛋白免疫印跡(Western Blotting)法檢測空白對照組、DMY組、VP16組以及DMY與VP16聯(lián)合組(DMY+VP16)絨癌JAR細胞中凋亡抑制蛋白BCL-2、c-IAP-2表達水平。結(jié)果:1.噻唑藍(MTT)檢測結(jié)果顯示,與空白對照組比較,DMY組、VP16組及DMY+VP16組在24h和48h時間點的絨癌JAR細胞存活率均下降,且DMY+VP16組絨癌JAR細胞存活率下降最為明顯。2.臺盼藍拒染實驗可見空白對照組絨癌JAR細胞形態(tài)正常,細胞數(shù)最高,視野中未見到藍染細胞;DMY組細胞數(shù)減少,視野中可見少量藍染細胞;VP16組細胞數(shù)減少,細胞變形,視野中可見少量藍染細胞;聯(lián)合用藥組細胞數(shù)顯著減少,細胞形態(tài)明顯異常,視野中可見了大量藍染細胞。3.Annexin-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,與對照組相比各實驗組JAR細胞凋亡率均有增高,DMY+VP16組JAR細胞凋亡率明顯高于各單獨用藥組。4.克隆形成實驗結(jié)果顯示,對于JAR細胞,實驗組的克隆球數(shù)目均少于對照組,且DMY+VP16組克隆球數(shù)目最少;對于正常肝臟HL7702細胞,DMY組與對照組相比無明顯差異,VP16組與DMY+VP16組相比亦無明顯差異。5.Western Blotting實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,無論DMY還是VP16均可下調(diào)絨癌JAR細胞中BCL-2、c-IAP-2蛋白表達,且DMY+VP16組下調(diào)作用最明顯。結(jié)論:二氫楊梅素聯(lián)合依托泊苷明顯增強對絨癌JAR細胞的生長抑制作用,聯(lián)合使用可以減少化療藥物VP16的用量,其抑制絨癌JAR細胞作用可能與下調(diào)BCL-2、c-IAP-2蛋白的表達有關(guān)。第二部分二氫楊梅素在絨癌JAR細胞中NF-κB通路的調(diào)節(jié)作用的研究目的:為探明DMY單獨及聯(lián)合VP16使用對絨癌JAR細胞中NF-κB通路是否存在調(diào)節(jié)作用。方法:1.利用蛋白免疫印跡(Western Blotting)法確定TNF-α的最適作用時間并研究DMY對TNF-α誘導(dǎo)不同時間下JAR細胞中p-ⅠκBα表達的影響。2.利用蛋白免疫印跡法檢測不同濃度DMY對JAR細胞內(nèi)p-ⅠκBα、ⅠκBα、NF-κB以及核轉(zhuǎn)位NF-κB的影響。3.利用蛋白免疫印跡法檢測分析DMY與VP16聯(lián)合使用對JAR細胞內(nèi)p-ⅠκBα、ⅠκBα、NF-κB以及核轉(zhuǎn)位NF-κB的影響。結(jié)果:1.隨著TNF-α作用時間的延長,JAR細胞中ⅠκBα表達量逐漸減少;而p-ⅠκBα的表達量先升高后降低,且TNF-α作用10min時,細胞內(nèi)p-ⅠκBα表達量最高;此外,實驗組(加DMY)細胞p-ⅠκBα表達量明顯低于對照組(不加DMY)。2.隨著DMY作用濃度增高,JAR細胞中ⅠκBα表達逐漸增加;而胞內(nèi)磷酸化形式p-ⅠκB表達量逐漸減少;胞內(nèi)NF-κB表達總量逐漸減少;發(fā)生核轉(zhuǎn)位的NF-κB也逐漸減少。3.DMY與VP16聯(lián)合作用的Western blotting結(jié)果可見,就ⅠκBα表達量而言,與對照組相比,各用藥組JAR細胞中ⅠκBα表達量均有減少,且聯(lián)合組ⅠκBα表達量降低最明顯;就胞內(nèi)p-ⅠκBα表達量而言,與對照組相比,各用藥組p-ⅠκBα表達量都有所減少,且聯(lián)合組p-ⅠκBα表達量明顯少于DMY組,但聯(lián)合組與VP16組相比,聯(lián)合組p-ⅠκBα表達量高于VP16組;就胞內(nèi)NF-κB表達總量以及核內(nèi)NF-κB的量而言,與對照組相比,各用藥組均有減少,且聯(lián)合組降低最明顯。結(jié)論:1.TNF-α最適作用時間為10min時,此時,JAR細胞內(nèi)磷酸活化形式的p-ⅠκBα表達量最高;2.DMY可以抑制各個TNF-α作用時間點細胞內(nèi)p-ⅠκBα表達量,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;3.DMY可能同時通過減少NF-κB的表達量和抑制ⅠκBα的磷酸化,來抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位過程;4.DMY與VP16聯(lián)合使用時通過協(xié)同減少NF-κB的表達量來減少轉(zhuǎn)位入核的NF-κB量。
【學(xué)位單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33

【參考文獻】

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本文編號：2821505