絨毛膜癌簡(jiǎn)稱絨癌(Choriocarcinoma),是一類滋養(yǎng)細(xì)胞的惡性腫瘤。近些年,化療藥物的應(yīng)用極大提高了患者的存活率,但由于傳統(tǒng)化療藥物嚴(yán)重的毒副作用限制了藥物療效和臨床應(yīng)用。二氫楊梅素(dihydromyricetin,DMY)是提取自葡萄科植物藤茶的一種黃酮類化合物,已有學(xué)者報(bào)道DMY能夠抑制胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。但在絨癌中的作用尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以人絨癌JAR細(xì)胞為研究對(duì)象,旨在說明DMY聯(lián)合VP16對(duì)絨癌JAR細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并初步探索DMY聯(lián)合VP16通過抑制JAR細(xì)胞中NF-κB的核轉(zhuǎn)位過程而發(fā)揮作用。為DMY聯(lián)合VP16在絨癌中的臨床治療提供理論依據(jù)。第一部分二氫楊梅素聯(lián)合依托泊苷對(duì)絨癌JAR細(xì)胞抑制作用的研究目的:探討二氫楊梅素(dihydromyricetin,DMY)聯(lián)合依托泊苷(etoposide,VP16)對(duì)絨癌JAR細(xì)胞的抑制作用及其相關(guān)的機(jī)制。方法:1.利用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)空白對(duì)照組、DMY組、VP16組以及DMY與VP16聯(lián)合組(DMY+VP16)各自絨癌JAR細(xì)胞增殖情況。2.利用臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)觀察空白對(duì)照組、DMY組、VP16組以及DMY與VP16聯(lián)合組(DMY+VP16)中被藍(lán)染的死亡JAR細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)。3.利用流式細(xì)胞術(shù)Annexin-FITC/PI雙染檢測(cè)分析空白對(duì)照組、DMY組、VP16組以及DMY與VP16聯(lián)合組(DMY+VP16)絨癌JAR細(xì)胞的凋亡率4.以正常肝臟HL7702細(xì)胞作為絨癌JAR細(xì)胞的正常對(duì)照細(xì)胞株,兩株細(xì)胞同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、DMY組、VP16組以及DMY與VP16聯(lián)合組(DMY+VP16),利用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞生存能力,觀察藥物的毒性作用。5.利用蛋白免疫印跡(Western Blotting)法檢測(cè)空白對(duì)照組、DMY組、VP16組以及DMY與VP16聯(lián)合組(DMY+VP16)絨癌JAR細(xì)胞中凋亡抑制蛋白BCL-2、c-IAP-2表達(dá)水平。結(jié)果:1.噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,DMY組、VP16組及DMY+VP16組在24h和48h時(shí)間點(diǎn)的絨癌JAR細(xì)胞存活率均下降,且DMY+VP16組絨癌JAR細(xì)胞存活率下降最為明顯。2.臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)可見空白對(duì)照組絨癌JAR細(xì)胞形態(tài)正常,細(xì)胞數(shù)最高,視野中未見到藍(lán)染細(xì)胞;DMY組細(xì)胞數(shù)減少,視野中可見少量藍(lán)染細(xì)胞;VP16組細(xì)胞數(shù)減少,細(xì)胞變形,視野中可見少量藍(lán)染細(xì)胞;聯(lián)合用藥組細(xì)胞數(shù)顯著減少,細(xì)胞形態(tài)明顯異常,視野中可見了大量藍(lán)染細(xì)胞。3.Annexin-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比各實(shí)驗(yàn)組JAR細(xì)胞凋亡率均有增高,DMY+VP16組JAR細(xì)胞凋亡率明顯高于各單獨(dú)用藥組。4.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)于JAR細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組的克隆球數(shù)目均少于對(duì)照組,且DMY+VP16組克隆球數(shù)目最少;對(duì)于正常肝臟HL7702細(xì)胞,DMY組與對(duì)照組相比無明顯差異,VP16組與DMY+VP16組相比亦無明顯差異。5.Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,無論DMY還是VP16均可下調(diào)絨癌JAR細(xì)胞中BCL-2、c-IAP-2蛋白表達(dá),且DMY+VP16組下調(diào)作用最明顯。結(jié)論:二氫楊梅素聯(lián)合依托泊苷明顯增強(qiáng)對(duì)絨癌JAR細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,聯(lián)合使用可以減少化療藥物VP16的用量,其抑制絨癌JAR細(xì)胞作用可能與下調(diào)BCL-2、c-IAP-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。第二部分二氫楊梅素在絨癌JAR細(xì)胞中NF-κB通路的調(diào)節(jié)作用的研究目的:為探明DMY單獨(dú)及聯(lián)合VP16使用對(duì)絨癌JAR細(xì)胞中NF-κB通路是否存在調(diào)節(jié)作用。方法:1.利用蛋白免疫印跡(Western Blotting)法確定TNF-α的最適作用時(shí)間并研究DMY對(duì)TNF-α誘導(dǎo)不同時(shí)間下JAR細(xì)胞中p-ⅠκBα表達(dá)的影響。2.利用蛋白免疫印跡法檢測(cè)不同濃度DMY對(duì)JAR細(xì)胞內(nèi)p-ⅠκBα、ⅠκBα、NF-κB以及核轉(zhuǎn)位NF-κB的影響。3.利用蛋白免疫印跡法檢測(cè)分析DMY與VP16聯(lián)合使用對(duì)JAR細(xì)胞內(nèi)p-ⅠκBα、ⅠκBα、NF-κB以及核轉(zhuǎn)位NF-κB的影響。結(jié)果:1.隨著TNF-α作用時(shí)間的延長(zhǎng),JAR細(xì)胞中ⅠκBα表達(dá)量逐漸減少;而p-ⅠκBα的表達(dá)量先升高后降低,且TNF-α作用10min時(shí),細(xì)胞內(nèi)p-ⅠκBα表達(dá)量最高;此外,實(shí)驗(yàn)組(加DMY)細(xì)胞p-ⅠκBα表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(不加DMY)。2.隨著DMY作用濃度增高,JAR細(xì)胞中ⅠκBα表達(dá)逐漸增加;而胞內(nèi)磷酸化形式p-ⅠκB表達(dá)量逐漸減少;胞內(nèi)NF-κB表達(dá)總量逐漸減少;發(fā)生核轉(zhuǎn)位的NF-κB也逐漸減少。3.DMY與VP16聯(lián)合作用的Western blotting結(jié)果可見,就ⅠκBα表達(dá)量而言,與對(duì)照組相比,各用藥組JAR細(xì)胞中ⅠκBα表達(dá)量均有減少,且聯(lián)合組ⅠκBα表達(dá)量降低最明顯;就胞內(nèi)p-ⅠκBα表達(dá)量而言,與對(duì)照組相比,各用藥組p-ⅠκBα表達(dá)量都有所減少,且聯(lián)合組p-ⅠκBα表達(dá)量明顯少于DMY組,但聯(lián)合組與VP16組相比,聯(lián)合組p-ⅠκBα表達(dá)量高于VP16組;就胞內(nèi)NF-κB表達(dá)總量以及核內(nèi)NF-κB的量而言,與對(duì)照組相比,各用藥組均有減少,且聯(lián)合組降低最明顯。結(jié)論:1.TNF-α最適作用時(shí)間為10min時(shí),此時(shí),JAR細(xì)胞內(nèi)磷酸活化形式的p-ⅠκBα表達(dá)量最高;2.DMY可以抑制各個(gè)TNF-α作用時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)p-ⅠκBα表達(dá)量,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3.DMY可能同時(shí)通過減少NF-κB的表達(dá)量和抑制ⅠκBα的磷酸化,來抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位過程;4.DMY與VP16聯(lián)合使用時(shí)通過協(xié)同減少NF-κB的表達(dá)量來減少轉(zhuǎn)位入核的NF-κB量。
【學(xué)位單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2821505