背景與目的子宮內(nèi)膜癌(Endometrial cancer,EC)是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率位居女性常見惡性腫瘤的第四位,且仍在不斷上升。傳統(tǒng)的EC分類方法是二分類法,依據(jù)臨床病理特征和發(fā)病機(jī)理將EC分為兩型:Ⅰ型(雌激素依賴型)和Ⅱ型(非雌激素依賴型)。然而,最近的研究發(fā)現(xiàn),相同類型的EC在分子和形態(tài)學(xué)特征上存在異質(zhì)性,因此一些研究基于分子突變等特點(diǎn)將EC分為不同亞型,以助于更好的個體化治療及預(yù)后風(fēng)險評估。盡管EC的總體預(yù)后較好,五年生存率可達(dá)82%,但是不同于許多其他類型惡性腫瘤近年來死亡率不斷下降,EC的死亡率從2010年到2015年間以每年2%的速率在不斷增長。EC預(yù)后的影響因素有很多,包括腫瘤的分期、分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等,但是目前對EC的疾病進(jìn)展機(jī)制并不十分明確,對于晚期患者仍缺乏有效的治療方法。因此,我們亟須對EC進(jìn)展的分子機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究,以利于對EC患者進(jìn)行精準(zhǔn)診斷和治療,從而提高患者預(yù)后。MicroRNA(miRNA)為一類長度約22個核苷酸的非編碼蛋白質(zhì)的RNA序列,近年來已被證實(shí)其在惡性腫瘤的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。miRNA主要通過種子序列與靶基因的互補(bǔ)序列識別,通過完全或部分互補(bǔ)的方式結(jié)合,使得靶基因在mRNA水平降解或者抑制其翻譯成蛋白質(zhì),進(jìn)而降低靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平,該序列常位于3'非翻譯區(qū)(un-translational region,UTR)。目前認(rèn)為miRNA可以參與包括腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移在內(nèi)多種生物學(xué)過程,并可調(diào)控接近三分之一人類基因的轉(zhuǎn)錄后水平。盡管現(xiàn)在已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn),有多種miRNA在EC組織與正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)存在差異,但是miRNA在EC發(fā)生發(fā)展中的確切作用機(jī)制尚不明確�，F(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn),miR-652通過作用于不同的靶基因在多種惡性腫瘤的發(fā)病及進(jìn)展中發(fā)揮重要功能,其中在乳腺癌和骨肉瘤中,miR-652能夠促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展,發(fā)揮促癌作用;而在惡性胸膜間皮瘤中miR-652抑制腫瘤侵襲遷移,發(fā)揮抑癌作用。但其在EC中的作用及機(jī)制目前尚無深入的研究。因此,本課題主要研究方向?yàn)閙iR-652在EC中的異常表達(dá)及其在EC疾病進(jìn)展中的作用,探究miR-652在EC中發(fā)揮作用的機(jī)制,為EC患者的治療提供新的治療思路。研究內(nèi)容分以下三個部分:1、miR-652在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床意義;2、miR-652在子宮內(nèi)膜癌中對增殖轉(zhuǎn)移能力的影響;3、miR-652在子宮內(nèi)膜癌中下游靶基因的篩選鑒定及功能研究。第一部分miR-652在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床意義研究目的:miR-652的表達(dá)在多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)。本課題組通過對癌癥基因圖譜(The cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫中EC的miRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)miR-652在EC組織中的表達(dá)水平明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織。本研究的主要目的在于驗(yàn)證miR-652在EC組織中的表達(dá)情況,并通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中的臨床信息進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)miR-652的表達(dá)與EC臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性,探究miR-652在EC臨床應(yīng)用中的重要價值。研究方法:對TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在EC組織和正常子宮內(nèi)膜組織中差異表達(dá)的miRNA。收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院從2015年4月至2017年12月期間手術(shù)的EC組織標(biāo)本共74例,其中正常子宮內(nèi)膜組織22例,子宮內(nèi)膜漿液性癌組織13例,子宮內(nèi)膜樣腺癌組織39例。提取收集組織中RNA,反轉(zhuǎn)錄后通過qRT-PCR對TCGA數(shù)據(jù)庫分析所得差異表達(dá)miRNA進(jìn)行組織驗(yàn)證。最后綜合文獻(xiàn)查閱、組織驗(yàn)證及miRNA在EC細(xì)胞中的功能,確定要進(jìn)行進(jìn)一步的研究miRNA。應(yīng)用Cox回歸分析miRNA的表達(dá)水平與EC患者預(yù)后的相關(guān)性,并對TCGA中的組織分期、分級、淋巴轉(zhuǎn)移、腹水細(xì)胞學(xué)等臨床數(shù)據(jù)和miRNA表達(dá)進(jìn)行分析,發(fā)miRNA與臨床信息的相關(guān)性,確定其臨床應(yīng)用中的意義及價值。研究結(jié)果:通過對TCGA數(shù)據(jù)庫分析篩選出56個在EC組織和正常子宮內(nèi)膜組織中差異表達(dá)的miRNA,其中miR-652在EC組織中的表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織,且為腫瘤特異性;通過對TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),miR-652在EC組織中的表達(dá)水平明顯高于正常子宮內(nèi)膜,組織標(biāo)本qRT-PCR驗(yàn)證所得結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)一致,并且發(fā)現(xiàn)miR-652在子宮內(nèi)膜漿液性癌組織中的表達(dá)高于子宮內(nèi)膜樣腺癌組織,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異;組織及細(xì)胞水平驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),在EC組織中,miR-652的表達(dá)與患者的月經(jīng)周期及是否絕經(jīng)無明顯相關(guān),在EC細(xì)胞中,在培養(yǎng)基中加入不同濃度的雌激素對miR-652的表達(dá)無明顯影響;;應(yīng)用Cox回歸分析發(fā)現(xiàn),EC組織中miR-652的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后有關(guān),miR-652的表達(dá)水平越高,患者的總生存期越短:進(jìn)一步臨床信息數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),miR-652的表達(dá)水平還與EC組織的分級及患者的復(fù)發(fā)密切相關(guān),miR-652高表達(dá)的EC組織分級較高,患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險較大。研究結(jié)論:miR-652在EC組織中的表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜組織;miR-652高表達(dá)的EC患者預(yù)后相對較差;miR-652有望成為EC患者預(yù)測復(fù)發(fā)及評估預(yù)后的重要指標(biāo)。第二部分miR-652在子宮內(nèi)膜癌中對增殖轉(zhuǎn)移能力的影響研究目的:研究證實(shí)miRNA參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的多個生物學(xué)過程,包括增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、自噬等。miR-652在多種惡性腫瘤的表達(dá)存在異常,并發(fā)揮不同的功能。在EC中,本課題組前期研究顯示miR-652在EC組織中的表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織,但miR-652在EC發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制尚無明確研究。本研究主要通過調(diào)控EC細(xì)胞系中miR-652的表達(dá),在體內(nèi)及體外水平研究miR-652在EC中的生物學(xué)功能,發(fā)現(xiàn)miR-652在EC的診斷、疾病進(jìn)展及治療中的應(yīng)用價值。研究方法:應(yīng)用兩種EC細(xì)胞系(Ishiakwa,AN3CA)瞬時轉(zhuǎn)染miR-652的mimics及inhibitor,分別過表達(dá)及干擾EC細(xì)胞系中miR-652的表達(dá)水平。在體外實(shí)驗(yàn)中,通過MTT實(shí)驗(yàn)及平板克隆實(shí)驗(yàn),檢測miR-652對EC細(xì)胞增殖能力的影響;應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)檢測,研究miR-652對EC細(xì)胞在周期及凋亡方面的影響;通過劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn),研究miR-652在EC細(xì)胞侵襲和遷移方面的作用;Western blot實(shí)驗(yàn)檢測EC細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal tranition,EMT)相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)用pGIPZ載體構(gòu)建miR-652穩(wěn)定過表達(dá)的EC細(xì)胞系,用miR-652過表達(dá)細(xì)胞及其對照細(xì)胞,分別進(jìn)行小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)及小鼠腹腔腫瘤細(xì)胞種植實(shí)驗(yàn),在體內(nèi)水平檢測miR-652對EC增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。研究結(jié)果:通過瞬時轉(zhuǎn)染分別構(gòu)建了miR-652過表達(dá)及干擾的細(xì)胞系,應(yīng)用pGIPZ載體成功構(gòu)建了miR-652穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞系;在體外實(shí)驗(yàn)中,通過MTT和平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-652能夠使細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng),干擾miR-652能抑制EC細(xì)胞的增殖;細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),miR-652穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)轉(zhuǎn)化,Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-652還能促進(jìn)EC細(xì)胞的侵襲和遷移能力,抑制miR-652的表達(dá)使細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯減弱;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)miR-652能促進(jìn)EC細(xì)胞的劃痕愈合能力,干擾miR-652能抑制EC細(xì)胞的劃痕愈合能力;Western blot實(shí)驗(yàn)顯示,過表達(dá)miR-652后,與EMT相關(guān)的指標(biāo)發(fā)生明顯變化,ZEB1、N-cad、Slug、Snail等促進(jìn)EMT的指標(biāo)表達(dá)增強(qiáng),E-cad等抑制EMT的指標(biāo)表達(dá)減弱;在體內(nèi)水平實(shí)驗(yàn)中,裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-652組小鼠的皮下腫瘤的體積及重量明顯大于對照組,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異,腹腔腫瘤種植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-652過表達(dá)組小鼠腹腔中腫瘤形成的個數(shù)及體積明顯大于對照組,研究表明miR-652在體內(nèi)及體外水平均能促進(jìn)EC的增殖和轉(zhuǎn)移;流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-652能促進(jìn)細(xì)胞周期,但對細(xì)胞的凋亡能力無明顯的影響。研究結(jié)論:miR-652在能夠促進(jìn)EC的增殖及轉(zhuǎn)移,在EC中發(fā)揮癌基因的作用,促進(jìn)EC的疾病進(jìn)展。第三部分 miR-652在子宮內(nèi)膜癌中下游靶基因的篩選鑒定及功能研究研究目的:研究發(fā)現(xiàn)miR-652在不同腫瘤中可通過與不同的靶基因結(jié)合發(fā)揮各自的生物學(xué)作用。本課題組已研究發(fā)現(xiàn)miR-652在子宮內(nèi)膜癌中能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移,發(fā)揮癌基因的功能,但是miR-652的在EC中發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚待研究。本研究主要是對miR-652的下游靶基因進(jìn)行篩選驗(yàn)證,研究下游靶基因在EC中的作用,探究miR-652在EC中發(fā)揮作用的具體機(jī)制。研究方法:對Targetscan,miRNAMap,miRDB等靶基因預(yù)測網(wǎng)站檢索結(jié)果進(jìn)行篩選,結(jié)合對miR-652過表達(dá)及對照細(xì)胞測序結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)miR-652可能的靶基因。應(yīng)用qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)分別在RNA及蛋白水平檢測EC細(xì)胞中過表達(dá)及干擾miR-652后RORA的表達(dá)水平變化。檢測EC組織和正常子宮內(nèi)膜組織中RORA在RNA及蛋白水平的表達(dá)差異。應(yīng)用IHC檢測RORA在小鼠皮下形成腫瘤中的表達(dá)強(qiáng)度及EC組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)差異。分析RORA的3'UTR區(qū)域是否存在miR-652的結(jié)合位點(diǎn)。為驗(yàn)證miR-652是否與RORA直接結(jié)合,構(gòu)建RORA的3'UTR的pmirGLO載體,進(jìn)行l(wèi)uciferase實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用Rescue實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-652是否通過RORA在EC中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用。對RORA的下游基因進(jìn)行研究,探索RORA在EC中發(fā)揮作用的機(jī)制。研究結(jié)果:通過Targetscan,miRNAMap,miRDB等靶基因預(yù)測網(wǎng)站檢測結(jié)果篩選發(fā)現(xiàn),RORA的3'UTR區(qū)域存在miR-652種子序列的結(jié)合位點(diǎn),在細(xì)胞測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-652后,RORA在RNA水平的表達(dá)下降,說明RORA可能是miR-652的下游靶基因;通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),RORA在EC組織中的表達(dá)低于正常子宮內(nèi)膜組織,qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測所得結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫相一致;qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在EC細(xì)胞系中過表達(dá)miR-652能降低RORA在RNA水平的表達(dá),Western blot實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果同qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致;在IHC研究中,通過對免疫組化染色強(qiáng)度評分發(fā)現(xiàn),RORA在EC組織中的染色強(qiáng)度低于正常子宮內(nèi)膜組織,且RORA的染色強(qiáng)度與患者是否絕經(jīng)及所處月經(jīng)周期無明顯相關(guān),在裸鼠皮下形成腫瘤中,過表達(dá)miR-652組RORA的染色強(qiáng)度低于對照組;Luciferase實(shí)驗(yàn)顯示,過表達(dá)miR-652能使野生型pmirGLO-RORA載體的熒光強(qiáng)度減弱,突變miR-652的結(jié)合位點(diǎn)后,熒光強(qiáng)度變化不明顯,說明RORA的3'UTR區(qū)域存在miR-652的結(jié)合位點(diǎn);Rescue實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)RORA能夠拯救miR-652過表達(dá)導(dǎo)致的EC細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng);為進(jìn)一步驗(yàn)證RORA在EC中的作用及機(jī)制,通過MTT及平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),干擾RORA能夠促進(jìn)EC細(xì)胞的增殖能力,Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,干擾RORA能使EC細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng);Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),干擾RORA能促進(jìn)β-catenin的表達(dá),以上結(jié)果顯示RORA在EC中發(fā)揮抑癌作用,且與β-catenin有關(guān)。研究結(jié)論:在EC中,RORA是miR-652的直接下游靶基因。miR-652通過調(diào)節(jié)miR-652/RORA/β-catenin通路在EC中發(fā)揮促癌作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

圖１．邋ＥＣ組織與正常子宮內(nèi)膜組織間差異表達(dá)ｍｉＲＮＡ的非監(jiān)督聚類逡逑系統(tǒng)樹圖顯示正常子宮內(nèi)膜組與ＥＣ組分別聚為一支。Ｎ表示正常子宮內(nèi)膜組ＥＥＣ表示子宮內(nèi)膜樣腺癌組織。紅色代表高表達(dá)水平，藍(lán)色代表低表達(dá)水平。逡逑４０逡逑

圖２．邋ｍｉＲ－６５２在ＥＣ組織中存在氋表達(dá)逡逑（Ａ，Ｂ）驗(yàn)證ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫中ｉｎｉＲ－ｌ８２－５ｐ與ｍｉＲ－４２９在ＥＣ組織與正常對照中的表逡逑達(dá)。（Ｃ）在ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫中，ｍｉＲ－６５２在ＥＣ組織中的表達(dá)高于正常對照組織。逡逑（Ｄ）ｑＲＴ－ＰＣＲ驗(yàn)證ｍｉＲ－６５２在ＥＣ組織中的表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜組織，且在ＥＳＣ逡逑中的表達(dá)水平高于ＥＥＣ。逡逑

圖３．邋ｍｉＲ－６５２在ＥＣ組織中的高表達(dá)為腫瘤特異性，與雌激素水平無關(guān)逡逑（Ａ）邐ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)分析結(jié)果示絕經(jīng)前后患者ＥＣ組織中ｍｉＲ－６５２的表達(dá)無明顯差別。逡逑（Ｂ）正常子宮內(nèi)膜組織中，ｍｉＲ－６５２的表達(dá)水平與月經(jīng)周期無關(guān)；ＥＣ組織中，逡逑ｍｉＲ－６５２的表達(dá)水平與是否絕經(jīng)無關(guān)。（Ｃ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔＥＣ細(xì)胞系中ＥＲ邋ａ在蛋逡逑白水平的表達(dá)。（Ｄ）在Ｉｓｈｉｋａｗａ細(xì)胞中，ｍｉＲ－６５２的表達(dá)水平與Ｅ２濃度及作用逡逑時間無明顯相關(guān)性。逡逑

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本文編號：2821296