發(fā)布時間：2020-09-15 15:02

　　 背景:1894 年 Fritsh 提出了宮腔粘連(Intrauterine Adheions,IUA)的概念,1948 年又由Asherman進一步定義,臨床表現(xiàn)為月經(jīng)量明顯減少、痛經(jīng)、閉經(jīng),繼發(fā)不孕、習(xí)慣性流產(chǎn)等,對育齡期婦女身體心理造成顯著傷害,近年來受到越來越多的關(guān)注。目前,臨床大多應(yīng)用以宮腔鏡下宮腔粘連分離術(shù)(transcervicalresectionof adhesion,TCRA)為主,術(shù)后給予多種輔助聯(lián)合治療。然而,由于各種方法都存在利弊,預(yù)后隨訪效果也無明顯差距,臨床治療法尚未統(tǒng)一。盡管術(shù)后人工周期藥物治療對子宮內(nèi)膜有一定的修復(fù)作用,在宮腔置放宮內(nèi)節(jié)育器與透明質(zhì)酸鈉可有效降低再粘連的發(fā)生,重度宮腔粘連術(shù)后復(fù)發(fā)率仍高達20.0%～62.5%。因此現(xiàn)階段的研究熱點即:尋找宮腔粘連術(shù)后有效地促進子宮內(nèi)膜再生以恢復(fù)宮腔形態(tài)和功能的治療方法。內(nèi)膜組織損傷被廣泛的認為是IUA發(fā)生的特異性危險因素,子宮內(nèi)膜組織損傷后產(chǎn)生的纖維變性組織對于粘連的形成有潛在作用。已發(fā)現(xiàn)多條信號通路及其相關(guān)蛋白共同參與宮腔粘連的發(fā)生發(fā)展。Hedgehog(Hh)信號通路作為當(dāng)下細胞內(nèi)信號通路的熱點,其中Shh配體的作用原理和功能在目前的研究中較為清楚。Shh信號通路在各階段生理過程中皆發(fā)揮作用,在胚胎發(fā)育的早期參與細胞的形成、增殖和分化,在胚胎發(fā)育的后期參與促進干細胞的形成和分化等。Shh信號通路的異常激活與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有著直接或間接的關(guān)系。已有研究提示Shh通路的異常激活在宮腔粘連的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮作用。由此,本研究以Shh信號通路為切入點,探討Shh信號通路及相關(guān)因子在正常子宮內(nèi)膜組織中的表達及在宮腔粘連發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用,接著研究Shh信號通路對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞增值以及對纖維化轉(zhuǎn)變的影響,為宮腔粘連術(shù)后藥物治療提供理論依據(jù)。方法:本研究選取2017年3月至2017年6月在浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院行宮腔鏡宮腔粘連分離術(shù)在術(shù)中及術(shù)后診斷為中重度宮腔粘連患者20例作為研究對象,宮腔鏡宮腔粘連分離術(shù)中以刮匙刮取粘連組織周圍的子宮內(nèi)膜及疤痕組織,同時取同期因其他原因行宮腔鏡探查非粘連患者的正常的子宮內(nèi)膜組織20例,術(shù)后病理結(jié)果分別為10例增生期,10例分泌期作為對照組。首先通過檢測Shh蛋白及其信號通路相關(guān)蛋白Ptch,Smo、Gli2、Gli3蛋白在增生期、分泌期子宮內(nèi)膜中定位及表達,接著比較宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜與正常增生期子宮內(nèi)膜中相關(guān)指標(biāo)(Collagen I,E-cadherin,Ki67)和Gli2定位和表達。通過子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染Gli2過表達質(zhì)粒,利用劃痕實驗觀察Shh信號通路抑制劑Cycloamine(Smo-dependent)和rShh的作用,并且探討Shh信號通路對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖以及對纖維化的影響。結(jié)果:本研究結(jié)果顯示在增生期內(nèi)膜中,Shh蛋白中等強度的表達,主要表達在間質(zhì)和腺上皮中。膜受體Smo在子宮內(nèi)膜中低度表達,膜受體Ptch則呈現(xiàn)散狀分布,主要表達在腺上皮和腔上皮,在間質(zhì)也有表達。Gli2、Gli3主要表達在上皮和腺體。在分泌期內(nèi)膜中,Shh蛋白中等強度的表達,主要表達在間質(zhì)中。Ptch、Smo低表達,特異性的表達主要在腺上皮,間質(zhì)也有表達。Gli2,Gli3強表達,表達在間質(zhì)和腺體。宮腔粘連患者的子宮內(nèi)膜組織(疤痕組織)中腺上皮細胞及胞質(zhì)均可見Collagen Ⅰ,Ki67蛋白陽性表達。在病灶部位的腺上皮中,E-cadherin的表達顯著升高。另外,轉(zhuǎn)染過表達Gli2后的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞,Gli2的表達亦升高,纖維化指標(biāo)CollagenI表達水平明顯上調(diào)。在劃痕試驗中,rShh可以促進子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的修復(fù),而cyclopamine則抑制子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的修復(fù)。結(jié)論:Shh信號通路在正常子宮內(nèi)膜的增生期和分泌期都發(fā)揮作用,且相對在分泌期內(nèi)膜中表達水平更高。Gli2,CollagenI,Ki67,蛋白在宮腔粘連患者宮腔組織中表達均較正常子宮內(nèi)膜表達增加,E-cadherin在粘連部位中腺上皮的表達上升,這就說明宮腔粘連是纖維化的過程,伴隨腺上皮上皮結(jié)構(gòu)和細胞的異常增生。在體外細胞實驗中,Shh信號通路能促進子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的修復(fù),促進纖維化指標(biāo)的升高。這些結(jié)果都表明Shh信號通路在促進宮腔粘連的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮重要作用。抑制Shh信號通路可能對于延緩宮腔粘連的進程有治療性意義。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R711.74
【部分圖文】：

邋Ｍａｓｓｏｎ染色，免疫組織化學(xué)分析Ｃｏｌｌａｇｅｎ邋Ｉ，Ｇｌｉ２蛋白在增生期子宮內(nèi)逡逑膜、宮腔粘連患者宮腔組織中定位及表徸；Ｂ，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ分析增生期子宮內(nèi)逡逑膜、宮腔粘連患者宮腔組織ＧＵ２蛋白表徸水平的比較（Ｐ＜０．０５＝）；邋Ｃ，Ｍａｓｏｏｎ和逡逑ＣｏｌｌａｇｅｎＩ，Ｇｌｉ２蛋白免疫組化的ＨＳＣＯＲＥ評分逡逑Ｆｉｇ４．邋Ａ，Ｍａｓｓｏｎ邋，邋Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣｏｌｌａｇｅｎＩ邋，邋Ｇｌｉ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ逡逑ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ邋ｐｈａｓｅ邋ａｎｄ邋ＩＵＡ邋ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ邋ｂｙ邋ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ逡逑Ｂ邋，邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋Ｇｌｉ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ邋ｐｈａｓｅ邋ａｎｄ邋ＩＵＡ逡逑ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ邋ｂｙ邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ．邋（Ｐ＜０．０５邋＝邋）；邋Ｃ，邋Ｍａｓｓｏｎ邋ａｎｄ邋ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ逡逑ａｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ＨＳＣＯＲＥ逡逑

邐２．４宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜（疤痕組織）與對照}D正常的增生期子宮逡逑內(nèi)膜中Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｋｉ６７蛋白的表徸和定位逡逑接著實驗檢測了邋Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，邋Ｋｉ６７在宮腔粘連患者宮腔組織中的表徶和位。選取宮腔粘連組織進行石蠟包埋和切片，利用免疫組化方法檢測Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｋｉ６７蛋白在宮腔粘連患者宮腔組織中的表徶和定位。逡逑研究結(jié)果顯示，與對照組正常增生期內(nèi)膜相比，患者的子宮內(nèi)膜組織（疤組織）中，子宮內(nèi)膜腺上皮細胞胞核可見Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白中等強度表達，表達顯增強；Ｋｉ６７主要散布在間質(zhì)中，腺上皮中亦存在。Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ在枯連部位中腺逡逑上皮的表達上升。這就說明宮腔粘連的發(fā)生有腺上皮上皮結(jié)構(gòu)和細胞的異常生。（Ｆｉｇ５．Ａ）隨后，我們對免疫組化的染色強度和面積進行Ｈ－ＳＣＯＲＥ評分，逡逑差異明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｆｉｇ５．Ｂ）。逡逑Ａ邐Ｒ邐Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ逡逑

數(shù)為具有成纖維細胞形態(tài)的梭形細胞，胞質(zhì)豐富，核橢圓，至少可穩(wěn)定傳代７—８次；逡逑用波形蛋白單克隆抗體進行免疫化學(xué)染色，在顯微鏡下觀察，后行免疫組化檢測，逡逑結(jié)果表明，原代培養(yǎng)的ＨＥＳＣ波形蛋白，陽性細胞占９５％以上（見圖６）。逡逑Ａ逡逑ｂ逡逑、，邋？逡逑Ｂ邋‘…、／（，，：逡逑ｌ邋＇ｒ．邋、．，邐＊邋？逡逑＼邋？邋＼邋：邋＂逡逑ｋ邋？逡逑ｍ逡逑圖６：子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。Ａ，原代分離培養(yǎng)的間質(zhì)細胞；逡逑Ｂ，為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞呈波形蛋白陽性逡逑Ｆｉｇ６．邋Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，邋Ｃｕｌｔｕｒｅ，邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ邋ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ邋ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌｓ逡逑２１逡逑

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本文編號：2819118