平衡易位是目前最為常見的染色體結(jié)構(gòu)異常,攜帶者大都無明顯的異常表型直至出現(xiàn)不良孕產(chǎn)史,對攜帶者進(jìn)行平衡易位精確斷點(diǎn)檢測,結(jié)合胎兒無創(chuàng)產(chǎn)前平衡易位檢測可以在早期知道胎兒的遺傳情況,具有重要的生育健康指導(dǎo)意義。目前臨床主要通過有創(chuàng)傷的穿刺術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前檢測,仍未有有效的無創(chuàng)傷性產(chǎn)前檢測的臨床手段。本研究主要使用高通量測序、生物信息學(xué)方法及針對游離DNA的分子檢測手段嘗試開發(fā)了基于孕婦血漿對胎兒父源性平衡易位遺傳的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)。本研究以已知父親為平衡易位攜帶者的家系樣本為研究對象,使用高通量測序技術(shù)分析父親平衡易位的精確斷點(diǎn)信息,隨后根據(jù)父親的平衡易位斷點(diǎn)設(shè)計(jì)適合于孕婦血漿胎兒游離DNA擴(kuò)增的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。并設(shè)立了一套平衡易位陽性模擬樣本建立的方法,通過對不同胎兒濃度梯度的陽性模擬樣本進(jìn)行檢測,確定檢測的最低檢出限。結(jié)合無創(chuàng)胎兒染色體非整倍體異常及染色體大片段缺失重復(fù)的檢測,分析胎兒平衡易位遺傳的情況,為平衡易位攜帶者家系提供孕早期的無創(chuàng)胎兒平衡易位遺傳的指示。本研究收集了一例父親為平衡易位攜帶者的家系作為研究對象。分別收集到孕婦孕早期和孕中期血漿進(jìn)行無創(chuàng)胎兒染色體非整倍體異常檢測并分析胎兒染色體大片段缺失、重復(fù)。隨后根據(jù)丈夫的平衡易位斷點(diǎn)設(shè)計(jì)適合于胎兒血漿游離DNA擴(kuò)增的特異性引物,通過對不同胎兒濃度梯度的陽性模擬樣本進(jìn)行檢測,確定檢測的最低檢出限可低至3.5%胎兒濃度。對孕婦血漿游離DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增,結(jié)合胎兒染色體數(shù)目異常結(jié)果進(jìn)行分析胎兒平衡易位遺傳情況,檢測結(jié)果顯示特異性擴(kuò)增到與父親相同的平衡易位片段,判定為平衡易位攜帶者。后續(xù)收集母親經(jīng)過羊水穿刺術(shù)的胎兒羊水細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證,與檢測結(jié)果一致,驗(yàn)證了方法的可行性。本研究提出了一種無創(chuàng)檢測胎兒父源性平衡易位的解決方案,在進(jìn)行胎兒染色體非整倍體異常檢測的同時(shí)進(jìn)行平衡易位的檢測,可操作性強(qiáng),可輔助目前臨床無創(chuàng)產(chǎn)前檢測,為患者提供早期的臨床指示。
【學(xué)位單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R714.5
【部分圖文】：

２．２樣本ＤＮＡ制備與提取逡逑２．２．１邋基因組ＤＮＡ提取逡逑研究收集了平衡易位家系中父親、母親和一孩的外周血樣本，使用ＱＩＡａｍｐＤＮＡ逡逑Ｂｌｏｏｄ邋Ｍｉｎｉ邋Ｋｉｔ邋（ＱＩＡＧＥＮ，Ｌｏｔ．邋１５１０４７４８０）提取試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行外周血基逡逑因組ＤＮＡ提取，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)流程如下，首先準(zhǔn)備５６邋°Ｃ水浴鍋、ＥＰ管、槍頭、逡逑離心機(jī)等《在１．５邋ｍＬ離心管中加入２０邋ｐＬ蛋ｆｔ酶Ｋ邋（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ），加入２００邋ｐＬ全血逡逑樣本，隨后加入２００邐Ｂｕｆｆｅｒ邋ＡＬ，使用混勻儀振蕩１５秒，充分混勻后放置于５６邋°Ｃ水逡逑浴鍋中進(jìn)行裂解，釋放出核酸。孵育１０分鐘，隨后簡短離心，使管蓋上的液體聚集回逡逑管底。加入２００邋ｐＬ無水乙醇，渦旋混勻１５秒后瞬時(shí)離心；小心將上步液體轉(zhuǎn)移到ＱＩＡｍｐ逡逑Ｍｉｎｉ邋ｓｐｉｎ

本文編號：2818638