目的1.尋找PCOS伴IR患者與PCOS伴Non-IR患者基本臨床特征及實驗室指征差異。利用蛋白質組學相關技術探索兩者血清差異蛋白,經篩選和驗證,鑒定出與PCOS伴Non-IR密切相關的蛋白質。2.建立PCOS-IR/Non-IR大鼠模型,進一步驗證人血清蛋白質芯片初篩結果及ELISA驗證結果。從臨床和基礎兩個層面,為未來PCOS伴Non-IR發(fā)病機制的探索提供依據。方法1.以2017年10月~2018年12月時間范圍內就診于蘭州大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科不孕不育門診,且被初次診斷為PCOS的育齡期患者為實驗組,同時募集于門診體檢的月經周期規(guī)律且已正常生育的育齡期非PCOS女性為對照組。最終獲得初診PCOS患者157例,對照組女性41例,在征得知情同意的前提下所有參與者均留取常規(guī)檢查后剩余血清樣本,-80℃保存。根據HOMA-IR(≥2.69)將初診PCOS患者分為IR組以及Non-IR組,最終實驗分組為Control 41例,IR組102例以及Non-IR組55例,對比分析三組患者的基本臨床特征和實驗室指征。利用高通量蛋白質芯片技術(包涵了640種細胞因子)對比檢測Control 1、Control2(作為技術重復)、IR組以及Non-IR組各組之間部分樣本混樣血清的蛋白表達,通過技術重復計算出SD值,以差異≥3倍SD值為卡值標準,分析數據并篩選出在IR組同Non-IR組血清中顯著差異表達的蛋白。后續(xù)進行擴大臨床樣本量驗證研究,采用ELISA試劑盒進行檢測。采用Graphpad prism 6.0、R 3.5.1軟件進行數據可視化。利用Cluster3.0軟件進行蛋白質的聚類分析,數據結果采用均數±標準差(?x±s)呈現(xiàn)。通過SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行相關數據的統(tǒng)計分析,以p0.05表示結果具有統(tǒng)計學意義。2.通過DEHA(脫氫表雄酮)(6mg/100g)SD大鼠頸部皮下注射20天誘導PCOS模型。通過對大鼠體重、陰道涂片、卵巢HE染色、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIN)以及性激素測定評估模型,根據HOMA-IR(≥2.8)進行PCOS大鼠IR組和Non-IR的分組。利用ELISA法對比檢測Control組、IR組以及Non-IR大鼠血清蛋白質的表達,旨在從PCOS整體動物水平進一步驗證前述通過人血清樣本蛋白質芯片所篩選出的與PCOS Non-IR密切相關的蛋白質分子。利用Graphpad prism 6.0軟件進行繪圖。數據結果采用均數±標準差(?x±s)表示。通過SPSS22.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析,p0.05表示結果具有統(tǒng)計學意義。結果1.Control組、初診PCOS IR組以及初診Non-IR組患者基本臨床特征和實驗室指征分析本研究最終納入了157例初診PCOS患者,Control組41例,平均年齡為26.29±3.38歲。根據HOMA-IR(≥2.69),157例初診PCOS患者被分為初診IR組102例,平均年齡為24.92±3.48歲,初診Non-IR組55例,平均年齡為24.93±3.22歲,患者年齡無顯著性差異。相對于Control組女性規(guī)律的月經周期而言,PCOS IR和Non-IR患者主要表現(xiàn)為月經周期延長或紊亂。超聲檢查顯示PCOS IR和Non-IR患者絕大部分均表現(xiàn)為雙側PCO。與Control組相比,PCOS IR組和Non-IR組的LH、LH/FSH以及T水平均升高,且差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),而IR組與Non-IR組之間無顯著差異。同Control組和Non-IR組相比,IR組空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIN)以及HOMA-IR均顯著升高(p0.05);Non-IR組FBG顯著高于Control組(p0.05),而兩組在FIN和HOMA-IR之間無顯著性差異。比較三組之間的BMI發(fā)現(xiàn),IR組患者中肥胖患者約占34.3%,Non-IR組中肥胖患者約占5.5%,而Control組女性的BMI基本均處于正常范圍(18.5~22.9kg/m~2)。2.基于蛋白質芯片的PCOS Non-IR組血清差異蛋白的篩選與驗證2.1 Non-IR組差異蛋白的篩選結果對蛋白質芯片結果進行重現(xiàn)性分析、PCA分析、k-means cluster聚類分析、t-test差異蛋白分析以及差異蛋白的功能學分析,最終同Control組和IR組相比較,我們篩選出了10種在Non-IR組中顯著差異表達且具有重要臨床診療意義的蛋白,包括Mer、Calcitonin、CA125、Procalcitonin、CA19-9、IL-1 F8、Pepsinogen II、CEA、AFP和CA15-3。通過功能學分析發(fā)現(xiàn)其中的CA125、CA19-9、CA15-3、CEA以及AFP這五種蛋白均是與腫瘤發(fā)生密切相關聯(lián)的血清腫瘤標記物。根據標準曲線,計算并統(tǒng)計這五種蛋白的血清濃度。結果發(fā)現(xiàn),同Control組和IR組比較,Non-IR組血清CA125、CA19-9、CEA以及AFP均顯著升高(p0.05);對比Control組,IR組和Non-IR組血清CA15-3均顯著升高(p0.05),而兩者之間無顯著性差異。2.2擴大樣本量的單樣本ELISA驗證結果根據患者臨床信息對其血清樣本進行篩選,最終用于進一步驗證芯片結果的樣本量為:Control組41例,IR組102例,Non-IR組55例。對比Control組和IR組,Non-IR組血清CA125、CA19-9、CEA以及AFP均顯著升高(p0.05),而Control組和IR組比較無顯著差異;對比Control組,IR組和Non-IR組CA15-3顯著增加(p0.05),而IR組和Non-IR組之間無顯著差異。3.PCOS大鼠模型的評估以及血清ELISA的驗證結果3.1 PCOS大鼠模型的評估在給藥第11天,對比Control組,IR組以及Non-IR組大鼠體重均明顯增加(p0.05),而IR組和Non-IR組之間無顯著差異;在給藥第14、17和20天這三個時間點,對比Control組,IR組和Non-IR組均呈現(xiàn)出體重的顯著增加(p0.05),且IR組較Non-IR組體重增加更加顯著(p0.05)。通過陰道涂片觀察陰道細胞學改變評估大鼠動情周期的變化,對比Control組,IR組和Non-IR組具備完整動情周期的大鼠比例均顯著下降,IR組約為18.2%,Non-IR組約為16.7%,而Control組中各大鼠的動情周期均正常。與Control組相比,IR組和Non-IR組卵巢濕重均顯著增加(p0.05),IR組和Non-IR組之間無顯著差異。通過卵巢HE染色,對比Control組,IR組和Non-IR組初級卵泡(PF)的比例增加顯著(p0.05),而IR組和Non-IR組形成的竇卵泡(AF)以及黃體(LH)的比例顯著降低(p0.05);IR組和Non-IR組兩組之間在PF、AF以及LH的形成上均無顯著差異。與Control組和Non-IR組比較,IR組空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIN)以及HOMA-IR均顯著升高(p0.05);Non-IR組較Control組FBG顯著升高(p0.05),Non-IR組和Control組在FIN以及HOMA-IR水平上均無顯著性差異。與Control組比較,IR組和Non-IR組E2和T水平均顯著增加(p0.05),兩組間無顯著性差異。三組在血清P、PRL、LH、FSH、LH/FSH水平上均無顯著差異。3.2 Control組、IR組以及Non-IR組大鼠血清腫瘤標記物的驗證結果與Control組相比,IR組和Non-IR組血清AFP水平均顯著升高(p0.05),且Non-IR組較IR組升高更為顯著(p0.05)。而三組之間在CA125、CA19-9、CA15-3以及CEA的水平上均未見顯著性差異。結論1.育齡期PCOS患者多表現(xiàn)為月經周期延長,并通常伴有胰島素抵抗和高雄激素血癥,PCOS胰島素抵抗患者中肥胖患者占比更高,PCOS患者多表現(xiàn)為雙側卵巢的多囊樣改變。2.PCOS Non-IR女性多種血清腫瘤標記物的的顯著上調,并結合PCOS動物水平的驗證研究,提示PCOS Non-IR女性患者罹患子宮內膜癌的風險增加。3.本研究為臨床上對于擴展PCOS Non-IR患者的規(guī)范診療內容以及加強后期的隨訪工作的重要性提出有意證據。
【學位單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R711.75
【部分圖文】：

占 5.5%；而 Control 組女性的 BMI 基本均處于正常范圍。本研究結果顯示，超重或肥胖常常是 PCOS 患者伴隨的重要臨床特征之一，且在 PCOS 伴胰島素抵抗患者中表現(xiàn)更為明顯。2.3.2 血清蛋白質芯片檢測結果的分析2.3.2.1 蛋白芯片檢測的原理示意圖蛋白質芯片的檢測原理可以簡單地概括為基于抗原抗體特異性的非共價結合，檢測方法主要有雙抗體夾心法和樣品標記法。本研究中所利用的蛋白質芯片技術主要采用了雙抗體夾心法，該方法是將捕獲抗體預先固定在固相載體上，加入需要檢測的生物樣品并進行孵育反應，通過生物樣品中特異性抗原與捕獲抗體的結合，然后加入生物素標記的檢測抗體一起孵育，最后通過 HRP（Horseradisperoxidase）-鏈霉親和素與化學發(fā)光底物作為信號檢測，檢測出生物樣品的熒光值，并最終計算出生物樣品中每種被檢測細胞因子的濃度。檢測原理如圖 2-3 所示。

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本文編號：2818010