目的1.尋找PCOS伴IR患者與PCOS伴Non-IR患者基本臨床特征及實(shí)驗(yàn)室指征差異。利用蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)探索兩者血清差異蛋白,經(jīng)篩選和驗(yàn)證,鑒定出與PCOS伴Non-IR密切相關(guān)的蛋白質(zhì)。2.建立PCOS-IR/Non-IR大鼠模型,進(jìn)一步驗(yàn)證人血清蛋白質(zhì)芯片初篩結(jié)果及ELISA驗(yàn)證結(jié)果。從臨床和基礎(chǔ)兩個(gè)層面,為未來(lái)PCOS伴Non-IR發(fā)病機(jī)制的探索提供依據(jù)。方法1.以2017年10月~2018年12月時(shí)間范圍內(nèi)就診于蘭州大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科不孕不育門(mén)診,且被初次診斷為PCOS的育齡期患者為實(shí)驗(yàn)組,同時(shí)募集于門(mén)診體檢的月經(jīng)周期規(guī)律且已正常生育的育齡期非PCOS女性為對(duì)照組。最終獲得初診PCOS患者157例,對(duì)照組女性41例,在征得知情同意的前提下所有參與者均留取常規(guī)檢查后剩余血清樣本,-80℃保存。根據(jù)HOMA-IR(≥2.69)將初診PCOS患者分為IR組以及Non-IR組,最終實(shí)驗(yàn)分組為Control 41例,IR組102例以及Non-IR組55例,對(duì)比分析三組患者的基本臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指征。利用高通量蛋白質(zhì)芯片技術(shù)(包涵了640種細(xì)胞因子)對(duì)比檢測(cè)Control 1、Control2(作為技術(shù)重復(fù))、IR組以及Non-IR組各組之間部分樣本混樣血清的蛋白表達(dá),通過(guò)技術(shù)重復(fù)計(jì)算出SD值,以差異≥3倍SD值為卡值標(biāo)準(zhǔn),分析數(shù)據(jù)并篩選出在IR組同Non-IR組血清中顯著差異表達(dá)的蛋白。后續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大臨床樣本量驗(yàn)證研究,采用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。采用Graphpad prism 6.0、R 3.5.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。利用Cluster3.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的聚類(lèi)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?x±s)呈現(xiàn)。通過(guò)SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,以p0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.通過(guò)DEHA(脫氫表雄酮)(6mg/100g)SD大鼠頸部皮下注射20天誘導(dǎo)PCOS模型。通過(guò)對(duì)大鼠體重、陰道涂片、卵巢HE染色、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIN)以及性激素測(cè)定評(píng)估模型,根據(jù)HOMA-IR(≥2.8)進(jìn)行PCOS大鼠IR組和Non-IR的分組。利用ELISA法對(duì)比檢測(cè)Control組、IR組以及Non-IR大鼠血清蛋白質(zhì)的表達(dá),旨在從PCOS整體動(dòng)物水平進(jìn)一步驗(yàn)證前述通過(guò)人血清樣本蛋白質(zhì)芯片所篩選出的與PCOS Non-IR密切相關(guān)的蛋白質(zhì)分子。利用Graphpad prism 6.0軟件進(jìn)行繪圖。數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?x±s)表示。通過(guò)SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,p0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.Control組、初診PCOS IR組以及初診Non-IR組患者基本臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指征分析本研究最終納入了157例初診PCOS患者,Control組41例,平均年齡為26.29±3.38歲。根據(jù)HOMA-IR(≥2.69),157例初診PCOS患者被分為初診IR組102例,平均年齡為24.92±3.48歲,初診Non-IR組55例,平均年齡為24.93±3.22歲,患者年齡無(wú)顯著性差異。相對(duì)于Control組女性規(guī)律的月經(jīng)周期而言,PCOS IR和Non-IR患者主要表現(xiàn)為月經(jīng)周期延長(zhǎng)或紊亂。超聲檢查顯示PCOS IR和Non-IR患者絕大部分均表現(xiàn)為雙側(cè)PCO。與Control組相比,PCOS IR組和Non-IR組的LH、LH/FSH以及T水平均升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),而IR組與Non-IR組之間無(wú)顯著差異。同Control組和Non-IR組相比,IR組空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIN)以及HOMA-IR均顯著升高(p0.05);Non-IR組FBG顯著高于Control組(p0.05),而兩組在FIN和HOMA-IR之間無(wú)顯著性差異。比較三組之間的BMI發(fā)現(xiàn),IR組患者中肥胖患者約占34.3%,Non-IR組中肥胖患者約占5.5%,而Control組女性的BMI基本均處于正常范圍(18.5~22.9kg/m~2)。2.基于蛋白質(zhì)芯片的PCOS Non-IR組血清差異蛋白的篩選與驗(yàn)證2.1 Non-IR組差異蛋白的篩選結(jié)果對(duì)蛋白質(zhì)芯片結(jié)果進(jìn)行重現(xiàn)性分析、PCA分析、k-means cluster聚類(lèi)分析、t-test差異蛋白分析以及差異蛋白的功能學(xué)分析,最終同Control組和IR組相比較,我們篩選出了10種在Non-IR組中顯著差異表達(dá)且具有重要臨床診療意義的蛋白,包括Mer、Calcitonin、CA125、Procalcitonin、CA19-9、IL-1 F8、Pepsinogen II、CEA、AFP和CA15-3。通過(guò)功能學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其中的CA125、CA19-9、CA15-3、CEA以及AFP這五種蛋白均是與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)聯(lián)的血清腫瘤標(biāo)記物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算并統(tǒng)計(jì)這五種蛋白的血清濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),同Control組和IR組比較,Non-IR組血清CA125、CA19-9、CEA以及AFP均顯著升高(p0.05);對(duì)比Control組,IR組和Non-IR組血清CA15-3均顯著升高(p0.05),而兩者之間無(wú)顯著性差異。2.2擴(kuò)大樣本量的單樣本ELISA驗(yàn)證結(jié)果根據(jù)患者臨床信息對(duì)其血清樣本進(jìn)行篩選,最終用于進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果的樣本量為:Control組41例,IR組102例,Non-IR組55例。對(duì)比Control組和IR組,Non-IR組血清CA125、CA19-9、CEA以及AFP均顯著升高(p0.05),而Control組和IR組比較無(wú)顯著差異;對(duì)比Control組,IR組和Non-IR組CA15-3顯著增加(p0.05),而IR組和Non-IR組之間無(wú)顯著差異。3.PCOS大鼠模型的評(píng)估以及血清ELISA的驗(yàn)證結(jié)果3.1 PCOS大鼠模型的評(píng)估在給藥第11天,對(duì)比Control組,IR組以及Non-IR組大鼠體重均明顯增加(p0.05),而IR組和Non-IR組之間無(wú)顯著差異;在給藥第14、17和20天這三個(gè)時(shí)間點(diǎn),對(duì)比Control組,IR組和Non-IR組均呈現(xiàn)出體重的顯著增加(p0.05),且IR組較Non-IR組體重增加更加顯著(p0.05)。通過(guò)陰道涂片觀察陰道細(xì)胞學(xué)改變?cè)u(píng)估大鼠動(dòng)情周期的變化,對(duì)比Control組,IR組和Non-IR組具備完整動(dòng)情周期的大鼠比例均顯著下降,IR組約為18.2%,Non-IR組約為16.7%,而Control組中各大鼠的動(dòng)情周期均正常。與Control組相比,IR組和Non-IR組卵巢濕重均顯著增加(p0.05),IR組和Non-IR組之間無(wú)顯著差異。通過(guò)卵巢HE染色,對(duì)比Control組,IR組和Non-IR組初級(jí)卵泡(PF)的比例增加顯著(p0.05),而IR組和Non-IR組形成的竇卵泡(AF)以及黃體(LH)的比例顯著降低(p0.05);IR組和Non-IR組兩組之間在PF、AF以及LH的形成上均無(wú)顯著差異。與Control組和Non-IR組比較,IR組空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIN)以及HOMA-IR均顯著升高(p0.05);Non-IR組較Control組FBG顯著升高(p0.05),Non-IR組和Control組在FIN以及HOMA-IR水平上均無(wú)顯著性差異。與Control組比較,IR組和Non-IR組E2和T水平均顯著增加(p0.05),兩組間無(wú)顯著性差異。三組在血清P、PRL、LH、FSH、LH/FSH水平上均無(wú)顯著差異。3.2 Control組、IR組以及Non-IR組大鼠血清腫瘤標(biāo)記物的驗(yàn)證結(jié)果與Control組相比,IR組和Non-IR組血清AFP水平均顯著升高(p0.05),且Non-IR組較IR組升高更為顯著(p0.05)。而三組之間在CA125、CA19-9、CA15-3以及CEA的水平上均未見(jiàn)顯著性差異。結(jié)論1.育齡期PCOS患者多表現(xiàn)為月經(jīng)周期延長(zhǎng),并通常伴有胰島素抵抗和高雄激素血癥,PCOS胰島素抵抗患者中肥胖患者占比更高,PCOS患者多表現(xiàn)為雙側(cè)卵巢的多囊樣改變。2.PCOS Non-IR女性多種血清腫瘤標(biāo)記物的的顯著上調(diào),并結(jié)合PCOS動(dòng)物水平的驗(yàn)證研究,提示PCOS Non-IR女性患者罹患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。3.本研究為臨床上對(duì)于擴(kuò)展PCOS Non-IR患者的規(guī)范診療內(nèi)容以及加強(qiáng)后期的隨訪工作的重要性提出有意證據(jù)。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R711.75
【部分圖文】：

占 5.5%；而 Control 組女性的 BMI 基本均處于正常范圍。本研究結(jié)果顯示，超重或肥胖常常是 PCOS 患者伴隨的重要臨床特征之一，且在 PCOS 伴胰島素抵抗患者中表現(xiàn)更為明顯。2.3.2 血清蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)結(jié)果的分析2.3.2.1 蛋白芯片檢測(cè)的原理示意圖蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)原理可以簡(jiǎn)單地概括為基于抗原抗體特異性的非共價(jià)結(jié)合，檢測(cè)方法主要有雙抗體夾心法和樣品標(biāo)記法。本研究中所利用的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)主要采用了雙抗體夾心法，該方法是將捕獲抗體預(yù)先固定在固相載體上，加入需要檢測(cè)的生物樣品并進(jìn)行孵育反應(yīng)，通過(guò)生物樣品中特異性抗原與捕獲抗體的結(jié)合，然后加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體一起孵育，最后通過(guò) HRP（Horseradisperoxidase）-鏈霉親和素與化學(xué)發(fā)光底物作為信號(hào)檢測(cè)，檢測(cè)出生物樣品的熒光值，并最終計(jì)算出生物樣品中每種被檢測(cè)細(xì)胞因子的濃度。檢測(cè)原理如圖 2-3 所示。

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本文編號(hào)：2818010