第一部分鄰苯二甲酸二丁酯影響孕鼠絨毛膜促性腺激素對胎鼠尿道下裂的意義目的通過檢測孕期DBP處理后的孕鼠血清中絨毛膜促性腺激素含量的變化,探究胎盤分泌絨毛膜促性腺激素的減少是否會引起后代雄性仔鼠睪丸中wnt/β-catenin通路中關鍵因子含量的變化,從而對胎鼠睪丸中經典wnt/β-catenin信號通路產生影響,減少StAR蛋白的表達以及睪酮的合成,探討DBP誘導SD大鼠發(fā)生尿道下裂的可能途徑,為探究尿道下裂的病因提出新思路。方法(1)選取從蘇州大學實驗動物中心購得的3月齡雌性SD大鼠45只,合籠后將孕鼠隨機分為兩組(對照組15只、DBP組30只)。于孕第13天到孕第19天,對孕鼠行灌胃處理,對照組按照3ml/kg體重玉米油的標準灌胃,DBP組將DBP按照800mg/kg的量溶入玉米油并混勻后以總劑量為3ml/kg體重的標準進行灌胃。兩組實驗動物均置于相同條件下進行飼養(yǎng)。(2)每只孕鼠于孕第13天到孕第19天經內眥靜脈取血,離心后保留血清并檢測其中絨毛膜促性腺激素水平變化。(3)在孕鼠懷孕第19天(GD19)取出胎鼠,鑒別出兩組中的雄性后代,將對照組雄性胎鼠設為正常對照組,DBP組雄性后代中根據尿道口位置鑒別出尿道下裂胎鼠,并設為DBP處理后尿道下裂組,將未發(fā)生尿道下裂的雄性胎鼠歸入DBP處理后正常組。觀察并拍攝各組的生殖結節(jié)圖片,同時測量所有雄性胎鼠的肛門-生殖結節(jié)距離(Anal genital nodule distance,AGD),統(tǒng)計尿道下裂發(fā)生率。取出各組胎鼠的生殖結節(jié)及睪丸組織,制成石蠟切片后用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)進行染色,于顯微鏡下觀察并拍攝圖片。(4)取出胎鼠過程中用斷頭取血法為各組胎鼠采血,離心后保留血清,檢測血清中的睪酮含量。取各組胎鼠睪丸并提取胎鼠睪丸組織的蛋白,應用Western blot方法檢測蛋白液中的StAR、GSK-3β、p-GSK-3β以及β-catenin蛋白的表達差異。結果(1)對孕鼠進行DBP處理后,雄性胎鼠的尿道下裂發(fā)生率為41.9%;DBP處理后尿道下裂組的尿道口均開口于生殖結節(jié)腹側,對照組和DBP處理后正常組的尿道口開口則均位于生殖結節(jié)的頂端。DBP處理后尿道下裂組的AGD(1.61±0.31mm)與DBP處理后正常組的AGD(2.09±0.55mm)數(shù)據之間的差別無明顯統(tǒng)計學意義,兩者均明顯小于對照組的AGD(2.93±0.44mm)。兩組數(shù)據之間的差異是具有統(tǒng)計學意義的。(p0.05)。(2)孕第13天DBP組孕鼠絨毛膜促性腺激素水平與對照組之間無明顯差別,孕第14及孕第15天DBP組孕鼠絨毛膜促性腺激素水平稍低于對照組,但數(shù)據差別不具有統(tǒng)計學意義。自孕第16天起DBP組與對照組相比孕鼠絨毛膜促性腺激素水平下降且數(shù)據具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。)(3)DBP處理后尿道下裂組睪酮含量(1.74±0.31ng/ml)對比對照組的睪酮含量(2.97±0.70ng/ml)明顯降低,且此此兩組數(shù)據的差異具有明顯統(tǒng)計學意義(p0.05)。而DBP處理后尿道下裂組睪酮含量雖略低于DBP處理后正常組睪酮含量(2.16±0.44 ng/ml),但兩組數(shù)據之間的差別無統(tǒng)計學意義。(4)進行對比的三組樣本的內參(β-actin、GAPDH)亮度基本一致,DBP處理后尿道下裂組StAR、β-catenin和GSK-3β的亮度略低于DBP處理后正常組,但均明顯低于正常對照組。相反p-GSK-3β(Ser9)的亮度則明顯高于其余兩組。結論DBP通過降低孕鼠血清中的絨毛膜促性腺激素水平,影響胎鼠睪丸中wnt/β-catenin通路中的關鍵因子的含量,從而影響StAR的表達,進而使睪丸中睪酮合成障礙,達到影響雄性胎鼠外生殖器發(fā)育的目的。第二部分鄰苯二甲酸二丁酯對胎鼠睪丸間質細胞分化的影響及意義目的研究鄰苯二甲酸二丁酯對胎鼠睪丸間質細胞分化的影響,探討鄰苯二甲酸二丁酯導致大鼠尿道下裂發(fā)生的可能機制。方法(1)將45只孕齡雌性SD大鼠配種并隨機分為對照組和DBP組。于孕第13天到孕第19天對孕鼠進行灌胃,DBP組按照800mg/kg體重DBP溶入玉米油(DBP和玉米油總劑量為3ml/kg體重)后灌胃,對照組按照3ml/kg體重玉米油灌胃,在將兩組大鼠置于相同條件下進行飼養(yǎng)。(2)于孕第19天取出胎鼠,鑒別出對照組中的雄性胎鼠,DBP處理后發(fā)生尿道下裂組的雄性胎鼠,與對照組中的雄性胎鼠一起分為尿道下裂組和正常對照組。(3)分別提取兩組胎鼠的睪丸組織,用差速貼壁法所獲得原代睪丸間質細胞,并于不同培養(yǎng)階段(2小時,12小時及48小時)對睪丸間質細胞標志物3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)進行檢測,測試其細胞活性及分泌功能。(4)取對照組雄性胎鼠睪丸組織,用差速貼壁法所獲得的原代睪丸間質細胞,原代培養(yǎng)2小時后用DBP配制染毒液染毒培養(yǎng),按照染毒液濃度分為對照組(0μmol/L)及實驗組(62.5、125、250、500、1 000μmol/L)。進行染毒處理培養(yǎng)12小時后對睪丸間質細胞標志物3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)進行檢測,測試其細胞活性及分泌功能。結果(1)尿道下裂模型建立結果見第一部分。(2)所有細胞生長狀態(tài)良好,原代培養(yǎng)2小時后,DBP組及對照組的睪丸間質細胞均為圓形,貼壁生長;對照組睪丸間質細胞在進行原代培養(yǎng)12小時后呈鋪展狀態(tài),幾乎所有細胞呈現(xiàn)分枝狀生長,僅部分細胞保留長梭形;細胞培養(yǎng)48小時后對照組細胞完全鋪展,全部呈現(xiàn)分枝樣。DBP組睪丸間質細胞在原代培養(yǎng)12小時后,大多數(shù)仍停留在長梭形狀態(tài),部分聚集稱為繩索狀;細胞培養(yǎng)48小時后開始呈現(xiàn)鋪展狀態(tài),呈現(xiàn)分枝狀。培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)未發(fā)現(xiàn)突變。(3)對照組在培養(yǎng)24小時后已出現(xiàn)長梭形細胞,且3β-HSD特異性染色陽性率高于染毒組。DBP染毒組濃度低于250μmol/L的三組細胞培養(yǎng)24小時后同樣出現(xiàn)梭形細胞,但3β-HSD染色陽性率低于于對照組。而染毒濃度為500μmol/L以及1000μmol/L的兩組細胞無論從分化程度上還是3β-HSD陽性率上都明顯下降。結論DBP可能通過對胎鼠睪丸間質細胞由胎兒型向成熟型轉變的過程產生影響,降低胎鼠睪丸的睪酮分泌,影響雄性胎鼠外生殖器發(fā)育進程而導致尿道下裂的發(fā)生。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R714
【部分圖文】：

鄰苯二甲酸二丁酯可能影響孕鼠絨毛膜促性腺激素分泌誘導雄性胎鼠尿道下裂的作用邐第一部分逡逑表２尿道下裂模型ＡＧＤ相關參數(shù)（）逡逑孕鼠邐雌鼠邐正常雄性胎鼠尿道下裂胎鼠逡逑ＤＢＰ邋組邐３０邐１．６１±０．４２ｍｍ邐２．０９±０．５５ｍｍ邐１．６１±０．３１ｍｍ逡逑對照組邐１５邐１．７１±０．３８ｍｍ邐２．９３±０．４４ｍｍ邐邐逡逑與對照組相比，＊ｐ＜０．０５逡逑

１．ＥＬＩＳＡ結果顯示：ＤＢＰ組孕鼠自孕第１４天（ＧＤ１４）起到孕第１９天（ＧＤ１中絨毛膜促性腺激素水平低于對照組，自孕第１６天（ＧＤ１６）起兩組的差異學意義（表３，圖２，／＞＜０．０５）。逡逑表３母鼠孕１３－１９天血清中絨毛膜促性腺激素的表達逡逑組邐ＤＢＰ組邐對照組逡逑邋含量邐ＧＤ１３邐１９＿７４±１．６１邐２０．４０±０．６０逡逑ＧＤ１４邐１９＿３５邋土邋１．９１邐２０．９７±０．７４逡逑ＣＧ邐ＧＤ１５邐１９．４９±１．５３邐２１．５７±０．８８逡逑Ｕ／ｍｌ）邐ＧＤ１６邐１９．７９±１．４７＊邐２２．１９±１．３３逡逑±１？）邐ＧＤ１７邐１９．１３士１．９９＊邐２３．０５±１．６５逡逑ＧＤＩ邋８邐１９．０７＋２．７８＊邐２３．５６±１．６８逡逑ＧＤ１９邐２０．３９±１．９３＊邐２２．９４士邋１．８０逡逑與對照組相比，＊ｐ＜０．０５逡逑３０邋ｎ逡逑

酯可能影響孕鼠絨毛膜促性腺激素分泌誘導雄性胎鼠尿道下裂的作用后尿道下裂組胎鼠的血清中的睪酮含量（１．７４±０．３１邋ｎｇ／ｍｌ）之間。逡逑表４胎鼠血清中睪酮的表達水平（ｉ邋±邋Ｓ邋）逡逑正常雄性胎鼠邐ＤＢＰ處理后正常組邋ＤＢＰ處理后尿２０邐２０邐２０逡逑２．９７±０．７０邐２．１６±０．４４邐１．７４±０．３１組相比，％＜０．０５逡逑４－

【參考文獻】

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8 靳曙光;張q

本文編號：2815662