第一部分麻醉藥對卵巢癌生長和轉(zhuǎn)移的不同影響目的:體外檢測麻醉藥物對卵巢癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、遷移和侵襲能力的影響。且檢測麻醉藥對在體卵巢癌生長和肺轉(zhuǎn)移的影響。方法:CCK-8和流式細(xì)胞儀檢測給予不同麻醉藥(利多卡因、七氟烷、丙泊酚)處理培養(yǎng)24h后對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響。Transwell檢測利多卡因和七氟烷對SKOV-3細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。構(gòu)建卵巢癌異種皮下移植模型和尾靜脈注射卵巢癌細(xì)胞構(gòu)建卵巢癌肺轉(zhuǎn)移模型,腹腔注射利多卡因和吸入七氟烷處理27天后,測量瘤體體積和重量評估對腫瘤生長的影響,及取肺做HE染色評估對肺轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果:相比Control組,利多卡因可濃度依賴性抑制SKOV-3細(xì)胞的增殖能力,細(xì)胞周期出現(xiàn)G2期阻滯,細(xì)胞凋亡率增加。而七氟烷使SKOV-3細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),G2期細(xì)胞增多,細(xì)胞凋亡率減少,而丙泊酚在臨床有效濃度內(nèi)只有在大于100μM時細(xì)胞增殖能力降低。利多卡因可使SKOV-3細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著減弱,七氟烷使細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)。在體腹腔注射利多卡因可顯著抑制腫瘤的生長及肺轉(zhuǎn)移,七氟烷可促進(jìn)腫瘤的生長和肺轉(zhuǎn)移。結(jié)論:利多卡因可濃度依賴性抑制細(xì)胞增殖,細(xì)胞周期阻滯,促進(jìn)凋亡。七氟烷可促細(xì)胞增殖,G2期細(xì)胞增加,細(xì)胞凋亡減少。利多卡因減弱細(xì)胞遷移和侵襲能力,七氟烷可增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲能力。在體腫瘤模型中,利多卡因可顯著抑制卵巢癌的生長和肺轉(zhuǎn)移,而七氟烷可促進(jìn)卵巢癌的生長和肺轉(zhuǎn)移。第二部分TASK-3通道涉及局麻藥和吸入麻醉藥對卵巢癌生長和轉(zhuǎn)移的影響目的:檢測TASK-3通道在人正常卵巢組織和卵巢癌組織標(biāo)本及人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3中的表達(dá),并探究TASK-3通道在利多卡因和七氟烷對卵巢癌細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲的影響及對在體卵巢癌生長和肺轉(zhuǎn)移的影響中的作用。方法:從協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科收集人正常卵巢組織和人卵巢癌組織標(biāo)本,及培養(yǎng)人正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE-80和人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3。用RT-PCR和Western blot檢測TASK-3通道m(xù)RNA和蛋白表達(dá)水平。構(gòu)建TASK-3 shRNA慢病毒后轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并篩選病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞,確定shRNA序列。分別用利多卡因和七氟烷處理SKOV-3和TASK-3 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測利多卡因和七氟烷處理對SKOV-3凋亡的影響,Transwell檢測上述處理對SKOV-3遷移、侵襲能力的影響。篩選TASK-3shRNA慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞,并構(gòu)建卵巢癌異種皮下移植模型和尾靜脈注射卵巢癌細(xì)胞構(gòu)建卵巢癌肺轉(zhuǎn)移模型,觀察腹腔注射利多卡因和吸入七氟烷處理27天后,對卵巢癌生長和肺轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果:相比于人正常卵巢組織,在mRNA和蛋白水平,TASK-3通道在人卵巢癌組織中均出現(xiàn)顯著上調(diào)。同樣,相比IOSE-80,TASK-3通道在SKOV-3中也出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。成功構(gòu)建和篩選TASK-3 shRNA慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)的SKOV-3細(xì)胞,TASK-3通道表達(dá)量顯著下降。給予利多卡因或TASK-3 shRNA后均可使細(xì)胞凋亡率增加,遷移和侵襲能力減弱。而TASK-3 shRNA預(yù)處理可減輕上述利多卡因的效應(yīng)。給予七氟烷后,SKOV-3細(xì)胞凋亡率降低,遷移和侵襲能力增強(qiáng)。TASK-3 shRNA預(yù)處理可減輕七氟烷的效應(yīng)。TASK-3 shRNA組,相比未做處理的對照組,小鼠腫瘤生長減緩,肺轉(zhuǎn)移減弱。利多卡因可顯著抑制卵巢癌的生長及肺轉(zhuǎn)移,TASK-3 shRNA預(yù)處理可減輕利多卡因的抗腫瘤效應(yīng)。七氟烷可促進(jìn)腫瘤的生長和肺轉(zhuǎn)移,TASK-3 shRNA預(yù)處理可減輕七氟烷的促腫瘤效應(yīng)。結(jié)論:TASK-3 shRNA和利多卡因可引起卵巢癌細(xì)胞凋亡增加,細(xì)胞遷移和侵襲減弱,TASK-3 shRNA可減輕利多卡因引起的上述效應(yīng)。而七氟烷可引起腫瘤細(xì)胞凋亡減少,細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng),TASK-3 shRNA預(yù)處理可減輕七氟烷的效應(yīng)。在體腫瘤模型中,利多卡因可顯著抑制卵巢癌的生長和肺轉(zhuǎn)移,而七氟烷可促進(jìn)卵巢癌的生長和肺轉(zhuǎn)移,TASK-3 shRNA預(yù)處理可減輕上述藥物效應(yīng)。第三部分線粒體TASK-3通道參與局部和吸入麻醉藥對卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響目的:檢測TASK-3通道在人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3中的亞細(xì)胞定位,并探究TASK-3通道在利多卡因和七氟烷對卵巢癌細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位、細(xì)胞色素C的影響中作用。方法:細(xì)胞免疫熒光檢測TASK-3通道細(xì)胞內(nèi)分布情況。篩選TASK-3 shRNA慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞,分別用利多卡因和七氟烷處理SKOV-3和TASK-3 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位,Western blot檢測細(xì)胞色素C(Cytochrome C)的變化。結(jié)果:線粒體主要集中在細(xì)胞核周圍,TASK-3通道除了分布在胞膜上,線粒體有大量分布,細(xì)胞核內(nèi)也有分布。給予利多卡因或TASK-3 shRNA后均可使細(xì)胞線粒體膜電位下降,Cytochrome C從線粒體漏入胞質(zhì),線粒體中Cytochrome C下降,胞質(zhì)中Cytochrome C增加。而給予七氟烷后細(xì)胞線粒體膜電位增加。結(jié)論:TASK-3通道在人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3線粒體中高表達(dá)。利多卡因可引起卵巢癌細(xì)胞線粒體膜電位下降,Cytochrome C從線粒體漏入胞質(zhì),啟動細(xì)胞凋亡,TASK-3shRNA可減輕利多卡因的效應(yīng)。七氟烷可引起腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位增加,TASK-3shRNA可減輕七氟烷對線粒體膜電位的效應(yīng)
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.31;R614
【部分圖文】：

0.1,1,2,5 mM。動物實驗用的是 3泊酚購置于阿斯利康公司，用乙醇配成 100養(yǎng)，配成 5,10,100μM。藥r: 制作 2 個 1.5L 的塑料容器（1 個實驗動物（inlet）和出口（outlet）,底部設(shè)一個小電風(fēng)好。分為 5% 二氧化碳， 21% 氧氣和其余為氮種氣體有限公司。入，體外細(xì)胞實驗將細(xì)胞培養(yǎng)板放入 Cham流量 5L/min，通氣 5min, 后打開七氟烷揮儀檢測七氟烷的濃度。

分為 5% 二氧化碳， 21% 氧氣和其余為氮種氣體有限公司。入，體外細(xì)胞實驗將細(xì)胞培養(yǎng)板放入 Cham流量 5L/min，通氣 5min, 后打開七氟烷揮儀檢測七氟烷的濃度。圖 1. 吸入七氟烷揮發(fā)罐

別加入 10μl PI 和 5μl Annexin-Ⅴ-FITC。吹打混勻后放入 4℃避光。上機(jī)檢測，選擇 BD 流式細(xì)胞儀的第 1，3 通道，檢測細(xì)胞-Ⅴ-FITC 和 PI 單染的未處理的細(xì)胞作為實驗的空白對照，每個每個實驗需三次重復(fù)。儀圈門，結(jié)果統(tǒng)計分析。well 實驗ell 實驗原理圖如圖 3，將細(xì)胞種于 Transwell 上室，上室給予予含血清培養(yǎng)基，細(xì)胞可趨化穿過聚碳酸酯膜向下室移動。當(dāng)atrigel，類似于細(xì)胞外基質(zhì)組分）時，細(xì)胞移動到下室，模擬估腫瘤細(xì)胞的遷移能力。當(dāng)膜上未鋪設(shè)基質(zhì)膠（Matrigel）時屬蛋白酶等物質(zhì)消化細(xì)胞外基質(zhì)，模擬細(xì)胞侵襲過程，用于評

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本文編號：2814753