本文關(guān)鍵詞：STBM在子癇前期腎臟損傷作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的:子癇前期(preeclampsia PE)的特點是妊娠后期(20周)新出現(xiàn)高血壓和蛋白尿,在我國的發(fā)病率為9.4%-10.4%1。PE常并發(fā)急性腎衰竭、子癇前期腎病、胎盤早剝、腦水腫、HELLP綜合征等。此外,由PE引發(fā)的多臟器功能紊亂對母兒造成嚴重的不良影響,同時增加了巨大的社會成本。目前尚無有效的治療方法,唯一的途徑是盡快結(jié)束分娩。PE的發(fā)病機制不明。目前已經(jīng)被普遍認同的是子癇前期的兩階段模型:第一階段:由于遺傳、免疫因子的異常調(diào)節(jié)等因素至絨毛外滋養(yǎng)細胞侵入不足和子宮螺旋動脈重塑障礙,引發(fā)胎盤淺著床為發(fā)病提供了解剖學基礎(chǔ);第二階段:子宮胎盤循環(huán)異常,局部缺血缺氧損傷,增強氧化應(yīng)激,增加了胎盤源性不良因子的釋放入母血循環(huán),導(dǎo)致母體內(nèi)皮細胞功能紊亂和過強的免疫應(yīng)答。這一切造成了PE的臨床表現(xiàn)如:蛋白尿、高血壓等。其中,胎盤源性不良因子的釋放是發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。合體滋養(yǎng)細胞微粒(STBM)是合體滋養(yǎng)細胞(Syncytiotrophoblast ST)凋亡或被激活時產(chǎn)生的帶膜囊泡狀結(jié)構(gòu),正常妊娠時外周血中也有少量的釋放,是重要的胎盤源性不良因子之一。研究表明:STBM的釋放除了引發(fā)機體凝血-纖溶平衡、激發(fā)母體系統(tǒng)性炎癥以外,對血管內(nèi)皮細胞亦有損傷。腎臟損傷在PE中較常見,表現(xiàn)為蛋白尿(proteinuria)增多、血肌酐(serum creatinine)等代謝產(chǎn)物升高及腎小球病理改變,是妊娠期合并腎臟疾病的主要原因。臨床上將子癇前期時出現(xiàn)蛋白尿和腎功能不全,稱為子癇前期腎病2。PE時,一方面全身微小動脈痙攣(包括腎小球小動脈收縮)、腎小球濾過屏障被破壞,致腎小球濾過率降低,血肌酐、尿素氮等代謝產(chǎn)物不能及時排出,蓄積在體內(nèi)表現(xiàn)為腎臟功能的損傷;另一方面,腎小球濾過屏障的損傷,血漿蛋白從濾過屏障滲出增多超過腎小管重吸收的范圍,產(chǎn)生腎小球性蛋白尿。蛋白尿不僅是子癇前期的診斷標準之一,更是PE嚴重程度(輕度PE:尿蛋白≥0.3g/24h;重度PE:尿蛋白≥5g/24h)的重要依據(jù),它的產(chǎn)生反應(yīng)腎小球濾過屏障的損害。腎臟血供豐富,腎小球是一個高度專業(yè)化的血液率過器,其本質(zhì)是一團毛細血管網(wǎng),極易受到血管收縮和內(nèi)皮損傷的影響。血管內(nèi)皮細胞是體內(nèi)分布最廣泛的細胞之一。它不僅有屏障功能,還是重要的內(nèi)分泌器官�？梢苑置诖倌�/抗凝因子(纖維蛋白溶酶原)、血管活性物質(zhì)(內(nèi)皮素(et)、一氧化碳(no)、前列環(huán)素(pgi)、血管緊張素(at))、細胞粘附分子、白介素等,參與調(diào)節(jié)血管的舒張、凝血/抗凝的平衡、免疫應(yīng)答、炎癥等3。電鏡下觀察pe患者的腎臟組織可見腎小球內(nèi)皮細胞腫脹、內(nèi)皮窗結(jié)構(gòu)被破壞,而足細胞裂孔膜并無明顯的改變,提示了內(nèi)皮細胞在pe腎臟病變中起重要作用4。我們通過模擬pe時外周血中stbm升高的情況,通過次c57小鼠制備類子癇模型,檢測小鼠腎臟功能及病理組織形態(tài)損傷的情況。從stbm致腎小球內(nèi)皮細胞(glomerularvascularendothelialcellgvec)損傷入手,檢測其增殖、凋亡和屏障功能的改變。為臨床pe腎損傷提供新的治療的靶點和思路。材料和方法:(一)stbm上調(diào)對孕鼠腎臟功能及腎臟病理形態(tài)的影響1.研究對象選取第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心的c57bl/6小鼠處鼠(8周齡)。2.機械法提取孕17天小鼠stbm。麻醉后反復(fù)消毒,剪開孕囊,將分離的胎盤迅速置于pbs(4℃)中。反復(fù)漂洗至pbs無色,去除殘留的蛻膜組織。將胎盤剪成細顆粒,置于含有雙抗的nacl溶液中,4℃震蕩過夜。次日離心:1000g,10min,4℃;棄沉淀離心:10000g,10min,4℃;棄沉淀離心:100000,60min,4℃。以5%蔗糖pbs重懸沉淀,㧟20℃冰箱保存。3.stbm蛋白濃度的測定。嚴格按照bca蛋白濃度測定試劑盒說明進行操作。4.透射電子顯微鏡觀察鑒定stbm。stbm稀釋45倍,滴液法制片,待樣品干燥后上機觀察。5.分組處理孕鼠。將孕鼠分為stbm組、pbs組、對照組。從孕8天起至孕17天,每天分別向孕鼠尾部注射stbm、pbs和不予處理。6.分別收集三組孕鼠的血液、尿液及腎臟標本。將孕17天的三組孕鼠分別置于小鼠代謝籠中,禁食,給予充足的飲水,24小時后收集尿液,記錄尿量,上機測定m-tp、m-tp/cr,根據(jù)m-tp和尿量計算24hu-tp。孕17天時,挖眼取血,將血液收集到1.5ml的ep管中,離心:3000r/min,15min。取血漿測定scr、bun、cys-c。分別取三組孕17天小鼠的腎臟組織,制備冰凍切片,光鏡下觀察。(二)stbm對腎小球內(nèi)皮細胞的影響1.嚴格按照納入標準和排出標準選擇大坪醫(yī)院重度子癇前期患者的胎盤組織(2013.12-2015.04)。2.提取人stbm。無菌條件下剪取胎盤母體中央面組織塊(1cmx1cmx1cm大小),置于冰pbs中,反復(fù)漂洗至pbs無色,去除蛻膜組織,將絨毛剪成碎屑,置于無菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)72小時。離心:1000g,20min,4℃;棄沉淀離心:10000g,20min,4℃;棄沉淀超速離心:100000g,60min,4℃;棄上清,用5%蔗糖pbs液重懸沉淀,-20℃凍存。3.hrgec的培養(yǎng):細胞復(fù)蘇、細胞傳代、細胞凍存。4.檢測stbm對hrgec增殖能力的影響。時間梯度:制備hrgec混懸液,按每孔約2000個細胞計數(shù),滴入96孔避光板中,移至細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。向各組加入等量stbm,分別干預(yù)6h、12h、24h、48h后終止。每孔加入cck-810μl,培養(yǎng)3小時酶標儀測定吸光度值(430-490mn)。濃度梯度:將stbm的濃度分別調(diào)整為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml,按上述方法分組檢測吸光度值。5.檢測stbm刺激后hrgec凋亡情況(tunel法)。制備細胞爬片,室溫下吹干、固定。分別向stbm組、h2o2組、對照組內(nèi)加入stbm、h2o2、完全培養(yǎng)基,作用24小時。固定、封閉、通透后用事先制備好的tunel反應(yīng)液按說明加入各組玻片上,暗室反應(yīng)1小時。pbs漂洗3次后dipa染細胞核。于熒光顯微鏡下觀察。6.westonblot檢測stbm刺激后hrgec凋亡情況。7.transwell小室檢測stbm對hrgec屏障功能的損傷。按照每孔1x106個細胞將hrgec接種在transwell上室(0.4μm)的纖維聚碳酸酯膜上,transwell小室置于24孔板中,培養(yǎng)至細胞完全融合。分別向stbm組、fbs組、對照組transwell上室中加入stbm(100ng/ml)、fbs、完全培養(yǎng)基。分別于24h、72h后向各組transwell上室中加入fitc-bsa。1小時后收集各組transwell下室中液體,上機檢測。結(jié)果:(一)stbm上調(diào)對孕鼠腎臟功能及腎臟病理形態(tài)的影響1.stbm蛋白濃度為0.67-1.28mg/ml,平均值為(0.87±0.24)mg/ml。2.透射電鏡下(hitachi-7500)觀察stbm呈現(xiàn)為膜性囊泡狀結(jié)構(gòu),與報道的人stbm(0.1μm-2μm)的直徑相近。3.尿液檢測:與pbs組和對照組相比,stbm組24hu-tp、m-tp/cr明顯升高。(p0.01)4.血液檢測stbm組孕鼠bun、scr、cys-c均顯著升高。(p0.05)5.stbm組腎小球體積增大,內(nèi)皮細胞腫脹,腎小管呈輕度云霧狀變性。對照組和PBS組腎臟組織無上述病理改變。(二)STBM對腎小球內(nèi)皮細胞的影響1.隨著STBM濃度的加大,作用時間的增加,對HRGEC增殖的抑制作用逐漸增強。2.通過Tunel實驗和PI3K/AKT信號通路發(fā)現(xiàn)STBM促進HRGEC凋亡。3.通過Transwell小室的檢測,分析STBM可能是致HRGEC屏障功能受損的原因之一。結(jié)論:1.小鼠STBM外周血回輸后,24h尿蛋白、尿蛋白/肌酐比值明顯升高,外周血肌酐、尿素氮、胱抑素-C顯著上調(diào),提示外周血STBM濃度上調(diào)損傷腎臟屏障功能。2.小鼠STBM外周血回輸引起腎小球損傷等腎臟組織病理形態(tài)改變,可能是腎臟屏障功能受損的主要病理生理機制。3.STBM對腎小球內(nèi)皮細胞的作用:抑制增殖,促進凋亡及對腎小球屏障功能損傷,使血管的完整性受損,推測是發(fā)生蛋白尿等一系列癥狀的原因之一。
【關(guān)鍵詞】：子癇前期 合體滋養(yǎng)細胞微粒 腎損傷 腎小球內(nèi)皮細胞 尿蛋白
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R714.244
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-15
• 第一章 前言15-17
• 第二章 STBM上調(diào)對孕鼠腎臟功能及腎臟病理形態(tài)的影響17-27
• 2.1 材料和方法17-23
• 2.2 實驗結(jié)果23-25
• 2.3 討論25-26
• 2.4 小結(jié)26-27
• 第三章 STBM對腎小球內(nèi)皮細胞的影響27-42
• 3.1 材料和方法27-35
• 3.2 實驗結(jié)果35-40
• 3.3 討論40-41
• 3.4 小結(jié)41-42
• 全文總結(jié)42-43
• 參考文獻43-46
• 文獻綜述 子癇前期腎損傷概述46-55
• 參考文獻51-55
• 在讀期間發(fā)表的論著55-56
• 致謝56

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本文編號：281065