第一章中國漢族早發(fā)性卵巢功能不全患者FSHR基因突變篩查及功能研究背景:早發(fā)性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency,POI),既往稱為卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF),是一種臨床特征和發(fā)病原因均呈高度異質(zhì)性的常見婦科內(nèi)分泌疾病。其臨床表現(xiàn)主要為原發(fā)性閉經(jīng)或女性40歲以前出現(xiàn)繼發(fā)性閉經(jīng),同時伴有促性腺激素升高與雌激素水平降低等引起的圍絕經(jīng)期癥狀。POI病因復(fù)雜,包括遺傳學(xué)因素、免疫學(xué)因素、代謝性因素、醫(yī)源性因素與環(huán)境因素等。40歲以前女性POI發(fā)病率約為1%,但近年來呈現(xiàn)上升趨勢。由于POI發(fā)病隱匿且呈不可逆性,目前尚無可靠的早期診斷指標(biāo),也無有效的干預(yù)或治療方法。因此,針對POI的病因?qū)W與早期識別高風(fēng)險人群的研究意義重大。目前研究已證實遺傳學(xué)缺陷是POI發(fā)病的重要原因,占POI發(fā)病因素的20%～25%。近年來,基于基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,通過候選基因篩查與全外顯子組測序等方法,目前已明確十余個POI致病基因。卵泡刺激素(Follicle-stimμlating hormone,FSH)是一種重要的生殖激素,通過與分布于性腺的卵泡刺激素受體(FSH receptor,FSHR)結(jié)合,激活下游的cAMP-PKA信號通路,引起靶蛋白發(fā)生磷酸化,從而參與并維持正常的性腺發(fā)育和生殖功能。FSHR基因是發(fā)現(xiàn)的第一個非綜合征型POI的致病基因。迄今為止,FSHR基因突變僅在芬蘭POI人群中有報道,而在其他種族人群中較為罕見,因此FSHR基因突變的致病性具有較強的種族特異性。目前尚無大樣本中國POI人群與FSHR基因相關(guān)性的報道。第一節(jié)中國漢族早發(fā)性卵巢功能不全家系FSHR基因突變篩查及功能研究目的:對一個中國漢族POI家系先證者及家系成員進行FSHR基因的突變檢測,并對潛在新發(fā)突變進行體外功能實驗,探討FSHR基因突變的致病機制。方法:先證者30歲,原發(fā)性閉經(jīng),染色體核型正常。先證者行腹腔鏡下卵巢組織活檢術(shù),活檢卵巢組織行HE染色。收集該POI家系成員與192例正常對照女性的外周血,抽提基因組DNA;采用Sanger法對先證者及其家人的FSHR基因的外顯子及其側(cè)翼序列進行測序,并在192例對照女性中對可疑突變進行驗證。體外構(gòu)建野生型和突變型質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染人胚胎腎細胞系HEK293T細胞。轉(zhuǎn)染后48h,分別采用Western blot和細胞免疫熒光法檢測目的蛋白的表達情況,采用cAMP試劑盒檢測FSH刺激后的cAMP生成情況。結(jié)果:Sanger法測序發(fā)現(xiàn)先證者攜帶1個新發(fā)純合無義突變c.175CT(p.R59X),其父母為雜合攜帶者,符合常染色體隱性遺傳。該突變導(dǎo)致FSHR蛋白由695個氨基酸截短為59個氨基酸,從而導(dǎo)致喪失重要功能域。保守性分析結(jié)果顯示,該突變所在位點氨基酸在各物種間保守性較高。Western blot和細胞免疫熒光結(jié)果顯示,R59X突變組未檢測到FSHR表達,提示R59X突變導(dǎo)致全長FSHR蛋白不能表達。cAMP實驗結(jié)果顯示,給予FSH刺激后,野生組cAMP水平逐漸升高,并在刺激后20 min左右達到峰值,R59X突變組cAMP水平無變化。此外,HE染色發(fā)現(xiàn)先證者卵巢活檢組織內(nèi)可見較多原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡及兩個直徑分別為0.25 mm和0.625 mm的早期竇卵泡。結(jié)論:本研究在POI家系中發(fā)現(xiàn)了 1個FSHR基因新發(fā)突變c.175CT(p.R59X),該突變導(dǎo)致FSHR蛋白功能喪失,從而阻斷卵泡發(fā)育,參與POI的發(fā)生。第二節(jié)中國漢族散發(fā)性早發(fā)性卵巢功能不全患者FSHR基因突變篩查及功能研究目的:探究中國漢族散發(fā)性POI患者FSHR基因突變情況,并對潛在新發(fā)突變進行功能研究。方法:收集192例中國漢族散發(fā)性POI患者與192例對照女性,抽提外周血基因組DNA;采用Sanger法對FSHR基因的外顯子及其側(cè)翼序列進行測序并對可疑突變進行驗證。體外構(gòu)建野生型和突變型質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染人胚胎腎細胞系HEK293T。轉(zhuǎn)染后48h,分別采用細胞免疫熒光法和流式免疫定量檢測目的蛋白的表達情況,采用cAMP試劑盒檢測FSH刺激后的cAMP生成情況,采用Western blot檢測FSH刺激后的ERK磷酸化水平。結(jié)果:對192例中國漢族散發(fā)性POI患者行FSHR基因測序,發(fā)現(xiàn)3個新發(fā)雜合突變:包括2個錯義突變c.793AG(p.M265V)和c.1789CA(p.L5971),以及1個同義突變c.1821CT。保守性分析結(jié)果顯示,597位點氨基酸在各物種間保守性較好。此外,在POI患者中篩查出6個已知SNP位點:rs1394205(5'UTR),rs115030945(外顯子 1),rs75552966(外顯子 8),rs6165(外顯子 10),rs6166(外顯子10)和rs140106399(3'UTR)。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,rs1394205和rs140106399的基因型和等位基因在病例組與對照組中的分布有統(tǒng)計學(xué)差異。細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示,野生組與M265V、L597I兩突變組均有FSHR的膜定位表達。流式免疫定量結(jié)果顯示,L597I突變組中FSHR的細胞膜定位較野生組顯著減少。cAMP實驗結(jié)果顯示,給予FSH刺激后,L597I突變組各時間點cAMP水平均低于野生型,M265V突變組各時間點cAMP水平與野生型無顯著性差異。Western blot結(jié)果顯示,給予FSH刺激后,野生組和兩突變組ERK1/2磷酸化均在5 min時達到峰值;L5971突變組各時間點ERK1/2磷酸化水平均低于野生組,M265V突變組各時間點ERK1/2磷酸化水平與野生型無顯著性差異。此外,L597I突變不具有顯性負效應(yīng)。結(jié)論:本研究在中國漢族散發(fā)性POI人群中發(fā)現(xiàn)了FSHR基因新發(fā)突變,FSHR基因在POI患者的突變頻率為1.6%(3/192),突變L597I影響了 FSHR蛋白的功能,參與POI的發(fā)生。第二章FSHR基因變異與中國漢族宮頸癌發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性研究背景:宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤,其發(fā)病率及死亡率僅次于乳腺癌。由于個體在遺傳水平上對宮頸癌的易感性有差異,因此我們通過基因的遺傳變異與疾病易感性或抵抗性的研究,可以獲悉宮頸癌的易感性或保護性基因型,從而獲得用于篩選宮頸癌易感或高危人群的分子標(biāo)簽。目前有關(guān)基因多態(tài)性與宮頸癌的研究主要包括炎癥免疫相關(guān)基因、細胞因子相關(guān)基因、代謝酶基因和DNA損傷修復(fù)基因等4類。卵泡刺激素FSH是最重要的女性激素之一,通過與其特異性的受體FSHR結(jié)合,在調(diào)控卵泡發(fā)育和雌激素合成等過程中發(fā)揮不可缺少的作用。目前已有較多關(guān)于FSH、FSHR與卵巢癌、乳腺癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究報道。此外,本課題前期研究在1例宮頸癌患者中發(fā)現(xiàn)FSHR基因R59X雜合突變,該突變曾在子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌患者中報道。最新研究顯示FSHR基因內(nèi)含子區(qū)的已知SNP(rs1007541)與突尼斯宮頸癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。這些均提示FSHR基因可能是宮頸癌的候選基因。目的:初步探討中國漢族宮頸癌患者FSHR基因突變及多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病的相關(guān)性。方法:收集2015年10月～2018年3月就診于山東省腫瘤醫(yī)院的130例宮頸癌患者與2018年1月～2018年3月就診于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院健康查體中心的200例健康女性的外周血,抽提基因組DNA;采用Sanger法對FSHR基因的編碼區(qū)及其側(cè)翼序列進行測序。采用HaploView 4.2軟件對各SNP進行哈代溫伯格平衡檢測。采用卡方檢驗比較各SNP在宮頸癌與對照組中的基因型和等位基因分布情況。采用Logistics邏輯回歸分析計算不同基因型和等位基因反映的疾病風(fēng)險性。結(jié)果:對130例中國漢族宮頸癌患者行FSHR基因測序,發(fā)現(xiàn)1個新發(fā)雜合錯義突變c.785AG(p.V262A)(3/130),該位點氨基酸具有較好的保守性。此外,在宮頸癌患者中篩查出7個已知SNP位點:rs1394205(5'UTR),rs115030945(外顯子 1),rs749571389(外顯子 3),rs757713421(外顯子 10),rs6165(外顯子10),rs6166(外顯子10)和rs140106399(3'UTR)。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,rs1394205(c.-29GA)和rs140106399(c.*111TC)的基因型和等位基因在病例組和對照組中的分布有統(tǒng)計學(xué)差異。Logistics回歸分析結(jié)果顯示,其中rs1394205位點與宮頸癌發(fā)病呈正相關(guān),AA基因型增加宮頸癌的患病風(fēng)險,A等位基因為宮頸癌的危險因素;rs140106399位點與宮頸癌發(fā)病呈負相關(guān),CC基因型降低宮頸癌的患病風(fēng)險,C等位基因為宮頸癌的保護性因素;但是由于研究樣本量相對較少且后者的較小等位基因頻率(MAF)偏低,所以其與宮頸癌的相關(guān)性有待進一步證實。結(jié)論:本研究首次在中國宮頸癌患者中發(fā)現(xiàn)了 1個FSHR基因新發(fā)突變c.785AG(p.V262A)(3/130),其功能影響有待進一步研究;此外發(fā)現(xiàn)FSHR基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病存在一定的相關(guān)性。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R711.75;R737.33
【部分圖文】：

圖１．先證者卵巢活檢組織的Ｈ＆Ｅ染色。（Ａ）顯示了卵巢皮質(zhì)內(nèi)較多的原始卵泡（ＰｒＦ）與逡逑初級卵泡（ＰＦ）邋（ｘ４００）；邋（Ｂ）顯示了由２？３層顆粒細胞圍繞中央的卵母細胞形成的次級卵逡逑泡（ＳＦ）邋（ＭＯＯ）；邋（Ｃ）顯示了兩個直徑約為０．６２５邋ｍｍ和０．２５邋ｍｍ的竇早期卵泡０４０）。逡逑圖２．邋ＰＯＩ家系圖及Ｒ５９Ｘ突變的相關(guān)信息逡逑Ａ邋ｉ邐ｐｆｊ邐＾邐Ｂ邋Ｔ邋ＴＣ７ＴＧ邋Ａ邋Ｔ邋ＴＣ７ＴＧ邋Ａ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｇ邋Ａ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｃ邋Ｇ邋Ａ逡逑ｎ邐４邐６邋八／ｖｗ＼邋ＡＡｍＡ邋／Ｗ／Ｖ＼邋Ａ／＇／ｗ＼逡逑２邐ｉ－ｉ邐ｉ－２邐ｎ－ｉ邐ｎ－２逡逑Ｃ邋Ｈｏｍｏ邋ＡｍＪＲＦＶＬＴＭ＾ＩＱＫＧＡｒｅＧｒｃ邋Ｄ邐＾邋＾邋＾邋＾邋＾逡逑Ｌａｒａｈｃ0邐，逡逑Ｓｕｓ邐ＡＶＨＬＲＦＶＬＴＫＬ邋Ｒ邋ＯＴＪＣＧＡＦＳＧＲ；邐＾邋＾邋＾逡逑Ｏｖｉｓ邋ＡＶＥＬＫＦＶＬＴＫＬＲｍＫＡＦＳＧＲ；邐ＩｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍＬｌＬＬＬ邋Ｘ邋Ｌｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ逡逑Ｍｕｓ邐ＡＩＨＪＲＦＶＬ１ＫＬ邋Ｒ邋ＯＴＫＧＳＦＳＯ＾邐Ｔｘｎ）逡逑Ｒａｔｔｕｓ邋ＡＩＥＬＫＦＶＬＴＫＬＲｎ？；＾ＡＣ３Ｒ＆邐，邐■邋Ｉ逡逑？；？？？？？？：＊：？：？￡？［邐＊邐ＴＬＸ邋ＴＪ邋ＸＪ邋Ｉ邋／—＞．ｗ逡逑ｐ．ｒＬ邐ｉｃｄ１邐ｕｉ＿ｃｏｏｈ逡逑

六．附錄與附圖逡逑圖１．先證者卵巢活檢組織的Ｈ＆Ｅ染色逡逑圖１．先證者卵巢活檢組織的Ｈ＆Ｅ染色。（Ａ）顯示了卵巢皮質(zhì)內(nèi)較多的原始卵泡（ＰｒＦ）與逡逑初級卵泡（ＰＦ）邋（ｘ４００）；邋（Ｂ）顯示了由２？３層顆粒細胞圍繞中央的卵母細胞形成的次級卵逡逑泡（ＳＦ）邋（ＭＯＯ）；邋（Ｃ）顯示了兩個直徑約為０．６２５邋ｍｍ和０．２５邋ｍｍ的竇早期卵泡０４０）。逡逑圖２．邋ＰＯＩ家系圖及Ｒ５９Ｘ突變的相關(guān)信息逡逑

圖３．邋ＰＯＩ家系成員的基因型分析。（Ａ）顯示Ｔａｑ邋Ｉ核酸內(nèi)切酶消化前的４９３邋ｂｐ全長目的片逡逑段；（Ｂ）顯示ＴａｑＩ核酸內(nèi)切酶消化后的ＰＣＲ產(chǎn)物，右側(cè)箭頭自上而下分別表示４９３邋ｂｐ全逡逑長片段以及Ｔａｑ邋Ｉ核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的３１８邋ｂｐ和１７５邋ｂｐ目的片段。逡逑圖４．Ｗｅｓｔｃｒｎ邋ｂｌｏｔ法檢測轉(zhuǎn)染后４８ｈ２９３Ｔ細胞中ＦＳＨＲ蛋白的表達情況逡逑ｃ0＾Ｓ邋＾邋＾逡逑１８０ｋＤ邋ｍ逡逑１４０ｋＤ邋Ｖ逡逑１００ｋＤ邋§逡逑＜—ＦＳＨＲ邋（－８７ｋＤ）逡逑７５ｋＤ邋ｆ．邐．逡逑６０ｋＤ邋？邐？逡逑４５ｋＤ邋｜逡逑３５ｋＤ邋■＞逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 石玉榮;耿建;程龍強;王慧;章堯;;細胞色素P450 1A1基因多態(tài)性與宮頸癌的相關(guān)性[J];復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2011年05期

本文編號：2809094