發(fā)布時間：2020-08-25 05:26

【摘要】：誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激是一些化療藥物的主要抗腫瘤機制之一,活性氧(ROS)對維持細(xì)胞氧化還原平衡起著至關(guān)重要的作用,可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。人們期待著通過各種方法增加氧化應(yīng)激以達到最大的抗腫瘤效果。另外,人們發(fā)現(xiàn)即使氧充足,腫瘤細(xì)胞依然主要通過糖酵解進行葡萄糖代謝,這有利于腫瘤細(xì)胞的快速增殖,人們將這種糖代謝的重編程稱為“Warburg效應(yīng)”。線粒體是氧化還原平衡、細(xì)胞凋亡的調(diào)控、細(xì)胞糖代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的交匯點,以往實驗研究表明,線粒體抗凋亡蛋白Bcl-2可能與抗氧化作用有關(guān),而最近的研究表明,Bcl-2家族蛋白不僅與凋亡相關(guān),還參與了細(xì)胞代謝的調(diào)控。因此,提示我們探討抗凋亡Bcl-2蛋白與細(xì)胞糖代謝、氧化應(yīng)激的關(guān)系,可能為闡明以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激為目標(biāo)的抗腫瘤機制提供新的線索。本研究以卵巢癌SKOV3細(xì)胞為研究對象,探究Bcl-2抑制劑ABT737對腫瘤細(xì)胞糖代謝重編程的調(diào)控作用以及整合氧化應(yīng)激與糖代謝重編程增加細(xì)胞凋亡的機制,為以氧化應(yīng)激為靶點治療腫瘤提供新的思路。實驗方法:1)MTT法檢測單加H_2O_2、單加ABT737以及H_2O_2與ABT737合加對SKOV3細(xì)胞存活率的影響。2)流式細(xì)胞術(shù)檢測單加H_2O_2、單加ABT737以及H_2O_2與ABT737合加對SKOV3細(xì)胞凋亡的影響,Western Blot檢測單加H_2O_2、單加ABT737以及H_2O_2與ABT737合加對SKOV3細(xì)胞凋亡蛋白表達的影響。3)使用100μM和300μM兩種濃度的H_2O_2處理SKOV3細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡檢測細(xì)胞ROS水平、線粒體膜電勢、線粒體ROS水平。4)流式細(xì)胞術(shù)檢測單加H_2O_2、單加ABT737以及H_2O_2與ABT737合加后細(xì)胞ROS水平,使用SOD試劑盒檢測SOD活力。5)流式細(xì)胞術(shù)檢測單加H_2O_2、單加ABT737以及H_2O_2與ABT737合加后細(xì)胞線粒體膜電勢和線粒體ROS水平。6)Western Blot檢測單加H_2O_2、單加ABT737以及H_2O_2與ABT737合加對細(xì)胞Sirt3、HIF-1α以及一些糖代謝相關(guān)蛋白表達的影響。7)使用葡萄糖攝取、乳酸生成試劑盒檢測單加H_2O_2、單加ABT737以及H_2O_2與ABT737合加后細(xì)胞的葡萄糖攝取、乳酸生成。實驗結(jié)果:1)H_2O_2和ABT737都能夠抑制SKOV3細(xì)胞的存活率,并且這種抑制作用表現(xiàn)出劑量依賴性,相比于H_2O_2單加組,合加組對SKOV3細(xì)胞存活率的抑制作用更加明顯。2)H_2O_2和ABT737都能夠使細(xì)胞凋亡率上升,相比于H_2O_2單加組,合加組凋亡率上升更加明顯;H_2O_2和ABT737都能夠影響凋亡相關(guān)蛋白的表達,使Bax、cleaved-caspase3表達水平上升。3)100μM和300μM兩種濃度的H_2O_2均可以使細(xì)胞ROS水平升高、線粒體膜電勢下降、線粒體ROS水平升高,且效果表現(xiàn)出劑量依賴性,說明H_2O_2復(fù)制氧化應(yīng)激模型成功,并且有可能通過氧化損傷機制來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。4)單加H_2O_2、單加ABT737以及H_2O_2與ABT737合加都能夠使細(xì)胞ROS水平升高,SOD活力下降,相比于H_2O_2單加組,合加效果更加明顯,說明H_2O_2和ABT737都能夠破壞氧化還原平衡,引起氧化應(yīng)激。5)單加H_2O_2、單加ABT737以及H_2O_2與ABT737合加都能夠使細(xì)胞線粒體膜電勢下降,線粒體ROS水平升高,相比于H_2O_2單加組,合加膜電勢下降更加明顯,但與單加H_2O_2相比,合加組線粒體ROS水平幾乎無上升,說明H_2O_2和ABT737都能夠損傷細(xì)胞線粒體。6)單加H_2O_2組Sirt3表達水平下降,HIF-1α表達水平上升,P-PDH/PDH比值降低;單加ABT737組、H_2O_2和ABT737合加組Sirt3表達水平上升,HIF-1α表達水平下降,Glut1、HK2、PKM2、LDHA表達水平均下降,P-PDH/PDH比值降低,說明ABT737有調(diào)控糖代謝重編程的作用。7)H_2O_2單加組葡萄糖攝取和乳酸生成略有上升,但無統(tǒng)計學(xué)意義;ABT737單加組、H_2O_2和ABT737合加組葡萄糖攝取和乳酸生成都下降,說明ABT737可以抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解。實驗結(jié)論:1)Bcl-2抑制劑ABT737能夠調(diào)控卵巢癌SKOV3細(xì)胞的糖代謝重編程,抑制糖酵解,減少葡萄糖攝取和乳酸生成,增強氧化磷酸化,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2)Bcl-2抑制劑ABT737能夠誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,并且通過對糖代謝重編程的調(diào)控作用增強氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡。綜上,我們推測靶向線粒體的抗腫瘤小分子化合物Bcl-2抑制劑ABT737通過細(xì)胞糖代謝途徑來增強氧化應(yīng)激誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的作用,可能是聯(lián)合其他藥物治療腫瘤的實驗基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31
【圖文】：

[30]。乳酸生成也可能是腫瘤代謝中的正反饋控制機制。由于乳酸的過度生成，細(xì)胞內(nèi)的 PH 下降，抑制糖酵解中的限速酶 PFK-1，最終的結(jié)果又是糖酵解。（3）線粒體功能的損傷。OXPHOS 是線粒體中的主要代謝途徑，但也可以產(chǎn)生破壞細(xì)胞的活性氧（ROS）和自由基。ROS 的過量產(chǎn)生可能引發(fā)大分子和細(xì)胞內(nèi)外信號通路的損傷，可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)展。LopezLázaro 假定腫瘤細(xì)胞具有獨特的代謝[31]。正常細(xì)胞更偏向于用氧和葡萄糖通過 OXPHOS 產(chǎn)生水和二氧化碳，但氧也被轉(zhuǎn)化為 ROS（例如 H2O2和 O2-），從而在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)糖酵解。此外，H2O2可以增強 Na+/ H+-ATPase 的活性，提高原癌基因的表達。O2-的形成導(dǎo)致癌細(xì)胞中的堿化，消耗質(zhì)子并刺激 PFK-1。線粒體解偶聯(lián)蛋白 UCP2 已經(jīng)被證明在幾種耐藥性腫瘤細(xì)胞系中過表達[32]，許多科學(xué)家認(rèn)為腫瘤細(xì)胞糖酵解增強是由于這種線粒體解偶聯(lián)蛋白。有研究顯示，UCP2 過表達導(dǎo)致的化療耐藥性顯著降低多種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡[33]。

由此引發(fā) RIP1 和 TRADD 從復(fù)合體 I 分離。然后 RIP1 和 TRADD 與 FADD和 caspase8、caspase10 結(jié)合，形成復(fù)合體 II[46, 47]。激活 caspase8、caspase10 之后，死亡信號就會被傳遞和放大，然后通過直接激活 caspase3、caspase6、caspase7或促進 Bax 和 Bak 與 Bid 結(jié)合來激活內(nèi)源性凋亡途徑。當(dāng)細(xì)胞毒性內(nèi)部刺激產(chǎn)生時，促凋亡蛋白 Bax 和 Bak 發(fā)生結(jié)構(gòu)變化并活化。Bax 和 Bak 轉(zhuǎn)移到線粒體并發(fā)生同型二聚化，暴露隱藏的結(jié)合位點，并將孔引入線粒體表面。這導(dǎo)致線粒體膜透化（MOMP）增加和蛋白從線粒體膜間隔（IMS）釋放[48, 49]。細(xì)胞色素 C 是最重要的 IMS 蛋白，它能夠引發(fā)凋亡體的形成。細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞色素 C 在 ATP 或 dATP 存在下與 caspase 銜接分子 Apaf-1 瞬時地結(jié)合，誘發(fā) Apaf-1 寡聚化形成輪狀七聚體，暴露其 caspase 活化和募集域（CARD）[50]。所以 Apaf-1 的 CARD 結(jié)構(gòu)域與 pro-caspase9 的 CARD 結(jié)合形成凋亡體。在這種復(fù)合結(jié)構(gòu)中，pro-caspase9 能夠發(fā)生二聚化并自動激活，活化的 caspase9 隨后激活 caspase3 和 caspase7，執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序。

3.2.2 細(xì)胞凋亡與腫瘤細(xì)胞凋亡作為腫瘤進展調(diào)節(jié)因子的重要性得到了明確的認(rèn)可[51]，多種在腫展中有影響的基因的活化可以調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡，最明顯的是 Bcl-2，fas 和 p53種腫瘤被證明與凋亡抑制相關(guān)，包括濾泡性淋巴瘤、具有 p53 突變的腫瘤依賴性腫瘤，比如乳腺癌，前列腺癌和卵巢癌[53, 54]。事實上，p53 腫瘤抑制在大多數(shù)人類癌癥中失活，來自多種人類惡性腫瘤的細(xì)胞具有降低的凋亡能。研究顯示腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷凋亡時抗性增加的分子基礎(chǔ)，并且定義了幾個在細(xì)亡調(diào)控中至關(guān)重要的基因[56]。Bcl-2 基因位于 14 至 18 號染色體之間的易位存在于大多數(shù)人類濾泡性淋巴瘤中[57]。研究證明 Bcl-2 可以控制細(xì)胞凋亡閾一系列基因[58]。此外，Bcl-2 家族蛋白中的一種抗凋亡蛋白 Bcl-xl 是 AP-圖 1.3 Bcl-2 家族蛋白與細(xì)胞凋亡

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Delia Mezzanzanica;;Ovarian cancer:a molecularly insidious disease[J];Chinese Journal of Cancer;2015年01期

本文編號：2803319