【摘要】：背景與目的:子宮內(nèi)膜蛻膜化是子宮間質(zhì)在各種激素的刺激下增殖和分化形成的一種特殊組織,指排卵后,由于激素水平改變,發(fā)生間質(zhì)重構(gòu)過程,其中包括子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橥懩ぜ?xì)胞。子宮內(nèi)膜蛻膜化對(duì)妊娠的建立和維持十分重要。蛋白質(zhì)糖基化是蛋白質(zhì)重要的翻譯后加工和修飾方式,分為N-糖基化和O-糖基化,參與了多種生理和病理過程,其中包括了胚胎植入過程等。著床糖生物學(xué)研究表明:蛋白質(zhì)糖基化與子宮內(nèi)膜接受性等生殖功能相關(guān)。蛋白質(zhì)巖藻糖基化是蛋白質(zhì)糖基化作用的一種重要形式,對(duì)于子宮內(nèi)膜功能有重要意義。然而,由特異的蛋白質(zhì)O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(poFUTs,protein O-fucosyltransferases)催化的O-巖藻糖基化在子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中的作用分子機(jī)制尚未清楚。本論文旨在探討蛋白質(zhì)O-巖藻糖基化對(duì)子宮內(nèi)膜蛻膜化的影響及其作用機(jī)制。方法:1.通過免疫組化檢測(cè)人正常未孕(增生期/分泌期)、正常早孕組織中poFUT1的表達(dá)。2.對(duì)基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo),利用qRT-PCR、ELISA、Western blot、免疫熒光方法檢測(cè)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜后poFUT1基因和蛋白的表達(dá)。3.調(diào)控poFUT1,利用Western blot和免疫熒光檢測(cè)蛻膜標(biāo)志物的表達(dá)。4.利用Western blot、CCK-8和免疫熒光檢測(cè)蛻膜后,poFUT1對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。5.通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)和Western blot檢測(cè)poFUT1是否可以影響Notch分子上的O-巖藻糖基化以及Notch的O-巖藻糖基化改變對(duì)Notch通路的影響。并通過Notch信號(hào)通路進(jìn)一步研究poFUT1對(duì)子宮內(nèi)膜蛻膜化的調(diào)控作用。6.對(duì)受孕小鼠宮角注射poFUT1-siRNA,通過免疫組化進(jìn)一步驗(yàn)證poFUT1在體內(nèi)對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中的作用。結(jié)果:1.收集臨床樣品包括人正常未孕(增生期/分泌期)和正常早孕組織,通過免疫組化結(jié)果分析得到:poFUT1在人子宮內(nèi)膜組織中增生期、分泌期、早孕期poFUT1表達(dá)依次增高。2.在基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程中poFUT1的表達(dá)增加。通過雌二醇(E2),甲羥孕酮17-乙酸酯(Medroxyprogesterone 17-acetate,MPA),和雙丁酰環(huán)磷酸腺苷(dibutyryl cAMP,dbc AMP)聯(lián)合使用對(duì)基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo),進(jìn)行形態(tài)學(xué)、qRT-PCR、ELISA、Western blot、免疫熒光分析,結(jié)果顯示,細(xì)胞從長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形,蛻膜化的標(biāo)志物PRL和IGFBP1的表達(dá)水平升高,證明基質(zhì)細(xì)胞已轉(zhuǎn)變?yōu)橥懩ぜ?xì)胞。對(duì)其進(jìn)行qRT-PCR、Western blot、免疫熒光實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示:與對(duì)照組比,基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化后poFUT1的表達(dá)升高。3.poFUT1促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化。Western blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組比,轉(zhuǎn)染poFUT1-siRNA后PRL和IGFBP1的表達(dá)水平降低,當(dāng)轉(zhuǎn)染poFUT1-cDNA后,PRL和IGFBP1的表達(dá)水平明顯升高。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致。4.poFUT1通過激活細(xì)胞周期蛋白,從而促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞增殖能力。Western blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組比,轉(zhuǎn)染poFUT1-siRNA,細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)和細(xì)胞周期蛋白(cyclin D1、CDK2、CDK6)的表達(dá)水平降低,轉(zhuǎn)染poFUT1-cDNA,細(xì)胞中PCNA和細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平升高。CCK-8結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染poFUT1-siRNA組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢于對(duì)照組細(xì)胞,而轉(zhuǎn)染poFUT1-cDNA后,細(xì)胞的生長(zhǎng)速度顯著高于對(duì)照組。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致。5.poFUT1通過上調(diào)Notch分子上的O-巖藻糖基化,激活Notch信號(hào)通路從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜蛻膜化。Western blot結(jié)果顯示:細(xì)胞蛻膜化后,總蛋白的O-巖藻糖表達(dá)上調(diào),當(dāng)轉(zhuǎn)染poFUT1-siRNA則下調(diào)O-巖藻糖的表達(dá),轉(zhuǎn)染poFUT1-cDNA,O-巖藻糖表達(dá)上調(diào)。IP結(jié)果顯示:用Notch1抗體進(jìn)行IP,與對(duì)照組比,轉(zhuǎn)染poFUT1-siRNA,Notch1上的O-巖藻糖和其配體Jagged-1表達(dá)下調(diào);轉(zhuǎn)染poFUT1-cDNA,它們的表達(dá)上調(diào);而轉(zhuǎn)染poFUT1-mutant,它們與對(duì)照組比未見明顯變化。證明Notch1上的O-巖藻糖表達(dá)對(duì)Notch通路產(chǎn)生影響。同時(shí)Western blot結(jié)果顯示:當(dāng)加入Notch信號(hào)通路抑制劑時(shí),PRL和IGFBP1的表達(dá)下調(diào)。6.小鼠宮角注射poFUT1-siRNA后小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化受到抑制,胚胎著床率降低。通過免疫組化實(shí)驗(yàn)證明:當(dāng)小鼠宮角注射poFUT1-siRNA后,IGFBP1和PCNA表達(dá)均明顯下降。結(jié)論:1.poFUT1在人子宮內(nèi)膜組織中增生期、分泌期、早孕期poFUT1表達(dá)依次增高。2.基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程中poFUT1表達(dá)水平增加。3.poFUT1促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞增殖。4.poFUT1通過上調(diào)Notch分子上的O-巖藻糖基化,激活Notch信號(hào)通路從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜蛻膜化。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R711.74
【圖文】：

圖.川口

A B圖 1 poFUT1 和 poFUT2 的受體底物巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶利用巖藻糖的GDP-巖藻糖形式來修飾靶中，GDP-巖藻糖可以通過兩條途徑合成，分別為頭合成途補(bǔ)救合成途徑（salvage pathway）（圖 2）。從頭合成路糖-4,6-脫水酶和 GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖-3,5 異構(gòu)酶-4-還成來自 GDP-甘露糖的 GDP-巖藻糖[11]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在一般的 GDP-巖藻糖是通過從頭合成路徑產(chǎn)生的[12]，一旦合運(yùn)輸?shù)礁郀柣w或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的內(nèi)腔中以供巖藻糖基

A B圖 1 poFUT1 和 poFUT2 的受體底物所有的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶利用巖藻糖的GDP-巖藻糖形式來修飾靶蛋白或脂質(zhì)哺乳動(dòng)物中，GDP-巖藻糖可以通過兩條途徑合成，分別為頭合成途徑（de noathway）和補(bǔ)救合成途徑（salvage pathway）（圖 2）。從頭合成路徑通過兩 GDP-甘露糖-4,6-脫水酶和 GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖-3,5 異構(gòu)酶-4-還原酶催化步反應(yīng)合成來自 GDP-甘露糖的 GDP-巖藻糖[11]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在一般情況下，哺物約 90％的 GDP-巖藻糖是通過從頭合成路徑產(chǎn)生的[12]，一旦合成后，GD藻糖會(huì)被運(yùn)輸?shù)礁郀柣w或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的內(nèi)腔中以供巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶利用

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李軍;杜鑫;Hosseini Moghaddam S.H.;陳玉銀;;蛋白質(zhì)糖基化修飾研究進(jìn)展[J];科技通報(bào);2009年06期

2 陳子江,石玉華;現(xiàn)代不孕癥的診斷治療及研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展;2004年01期

本文編號(hào)：2802482