【摘要】：研究背景:染色體異常是引起稽留流產(chǎn)(Missed abortion,MA)的主要原因。隨著基因組學(xué)的發(fā)展及檢測(cè)方法的進(jìn)步,深入探尋MA遺傳學(xué)層面的發(fā)病機(jī)制逐漸成為當(dāng)前的研究方向。本研究采用全外顯子測(cè)序(Whole-exome sequencing,WES)技術(shù)對(duì)染色體檢測(cè)正常的稽留流產(chǎn)保存的妊娠組織(the retained products of conception,POC)進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)生物信息學(xué)分析尋找WES結(jié)果中早期胚胎(胎兒)發(fā)育停滯或死亡相關(guān)的重要基因,有助于為研究MA的發(fā)生機(jī)制提供新思路。國(guó)內(nèi)外在POC中通過(guò)WES分析研究MA相關(guān)基因的報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)研究分兩部分完成。一、傳統(tǒng)染色體核型分析及高通量測(cè)序檢測(cè)稽留流產(chǎn)絨毛組織目的:比較傳統(tǒng)染色體核型分析與基于高通量測(cè)序(next generation sequencing,NGS)的染色體組拷貝數(shù)分析(copy number variation analysis,CNVA)對(duì)稽留流產(chǎn)POC的檢測(cè)結(jié)果,探討兩種方法診斷POC染色體的一致性以及各自的優(yōu)勢(shì)和局限性。方法:收集69例稽留流產(chǎn)POC,分別用傳統(tǒng)染色體核型分析與NGS檢測(cè)其染色體,分析兩種方法得到的結(jié)果。結(jié)果:①傳統(tǒng)染色體核型分析較NGS-CNVA診斷成功率低(p0.05)。②傳統(tǒng)染色體核型分析法在所有樣本中的染色體異常檢出率顯著低于NGS方法(p0.05)。③兩種方法均發(fā)現(xiàn)MA標(biāo)本中以染色體數(shù)目異常為最常見(jiàn)類(lèi)型,其中又以常染色體異常多見(jiàn)。④兩種方法檢測(cè)結(jié)果相符率高達(dá)93.33%。⑤兩種方法檢測(cè)染色體正常的有12例。結(jié)論:傳統(tǒng)染色體核型分析和NGS兩種方法檢測(cè)POC染色體各有優(yōu)缺點(diǎn),檢測(cè)結(jié)果一致性較高,有效結(jié)合可以更好地提高診斷效能。二、對(duì)染色體正常的稽留流產(chǎn)標(biāo)本行全外顯子測(cè)序及生物信息分析目的:對(duì)染色體正常的不明原因稽留流產(chǎn)POC行WES,查找MA的遺傳學(xué)病因,發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致早期胚胎(胎兒)死亡的重要基因及變異。方法:①對(duì)染色體正常的不明原因流產(chǎn)絨毛組織標(biāo)本提取的DNA行WES。②通過(guò)小鼠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Mouse Genome Informatics,MGI)找到在以往小鼠遺傳學(xué)研究中存在胚胎發(fā)育異常、胚胎致死或胚胎發(fā)育停滯的基因。③對(duì)WES數(shù)據(jù)篩選、分析及驗(yàn)證。結(jié)果:①第一部分染色體正常的12例標(biāo)本因待檢DNA降解嚴(yán)重?zé)o法進(jìn)一步檢測(cè)。②對(duì)染色體正常的19份新鮮標(biāo)本行WES,并進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選、分析及驗(yàn)證結(jié)果。③通過(guò)生物信息學(xué)分析工具分析,篩選出36個(gè)罕見(jiàn)突變,涉及32個(gè)基因。④LDB1雜合突變c.662CT變異通過(guò)多種預(yù)測(cè)工具分析為致病等位基因,變異極為罕見(jiàn),被預(yù)測(cè)為與胚胎死亡有關(guān)高致病性變異,POC中的LDB1突變與MA發(fā)生可能有關(guān)。⑤發(fā)現(xiàn)DIDO1、LIAS、ATE1、OTX2、NF1、PTCH1、TRIM28、GAS1、INTS1、SRRT 和 CREBBP 也是可能導(dǎo)致MA的候選基因。結(jié)論:WES技術(shù)結(jié)合生物信息分析技術(shù)用于染色體正常的稽留流產(chǎn)POC檢測(cè)與分析,可以得到胚胎的全外顯子組信息,發(fā)現(xiàn)可能引起孕早期胚胎(胎兒)死亡的基因突變。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R714.5
【圖文】：

２．９．２各染色體中心�；蚨肆Ｎ恢糜煤谏狞c(diǎn)表示。逡逑２．９．３縱坐標(biāo)軸為拷貝數(shù)，正常人胚胎是二倍體，常染色體拷貝數(shù)應(yīng)為２；性染色體：逡逑Ｘ兩個(gè)拷貝（女性），或Ｘ、Ｙ各一個(gè)拷貝（男性）。如圖１所示為染色體為４６，ＸＸ、逡逑１５逡逑

解放軍醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文基因本體（Ｇｅｎｅ邋Ｏｎｔｏｌｏｇｙ，ＧＯ）分析，我們發(fā)現(xiàn)這３２個(gè)基發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程中，例如脊索動(dòng)物胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖以。其中邋７邋個(gè)基因（兄４７Ｚ４，邐＆４ＬＫ，／／５Ｆ７，邋／ＡＴＷ，b6ｒＣ／Ｗ物胚胎發(fā)育生物過(guò)程中，５個(gè)基因（ＸＤＭＬ４，邋ｉＶＯｒＣｆｆｌ，邋７ＶＦ／，邋ＯＬ發(fā)育過(guò)程中。這１２個(gè)基因均有文獻(xiàn)證實(shí)任何一個(gè)被敲除后將死亡。逡逑３２個(gè)ＭＡ關(guān)聯(lián)基因的基因注釋?zhuān)ǎ牵希┓治鲥义希哌姡义?

通過(guò)ＰＣＲ擴(kuò)增ＬＤ５７基因突變兩側(cè)區(qū)域約５００－６００邋ｂｐ，ＰＣＲ產(chǎn)物交由測(cè)序公司逡逑進(jìn)行Ｓａｎｇｅｉ？測(cè)序反應(yīng)，之后我們通過(guò)分析測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在基因編碼區(qū)第６６２逡逑位確實(shí)存在Ｃ突變?yōu)椋缘碾s合變異（圖３）。因此驗(yàn)證結(jié)果與全外顯子組測(cè)序結(jié)果逡逑相符。逡逑ＬＤＢ１，逡逑ｃ．６６２Ｃ＞Ｔ逡逑１逡逑Ｇ邋Ａ邋ＧＣＴ邋ＣＡＴ邋Ｇ邋Ｔ邋Ｔ邋－邋Ｃ邋６邋Ｃ邋Ｃ邋Ａ邋Ｃ邋Ａ邋Ａ．邋Ｇ逡逑圖３邋Ｓａｎｇｅｒ測(cè)序驗(yàn)證了邐基因編碼區(qū)第６６２位確實(shí)存在Ｃ突變?yōu)椋缘碾s合變異逡逑四、討論逡逑本研究旨在發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致早期胚胎（胎兒）死亡的重要基因及變異。近日有研究發(fā)逡逑現(xiàn)１０３個(gè)產(chǎn)前致死有關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)其中約６８％的基因突變都會(huì)導(dǎo)致胎盤(pán)畸形，而逡逑早期胚胎死亡幾乎都與嚴(yán)重的腦、心臟和血管的發(fā)育異常等胚胎畸形有關(guān)［７４］。已有逡逑大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，與胚胎期心臟及血管等發(fā)育相關(guān)的基因，如八逡逑Ｇｒｋ２、Ｈｏｐｘ、ｈｌｌ、Ｌｄｂｌ、Ｍａｐｋ７、Ｓｌｃ８ａｌ、Ｓｒｆ、Ｔｂｘ２０邋等，敲

本文編號(hào)：2792095