【摘要】：背景和目的:卵巢癌是女性盆腔生殖器官三大惡性腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌而位居第三位,近年來卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率一直持上升的趨勢(shì),每年以1%0的速度增長。由于卵巢位于盆腔的深處,缺少特異性的早期檢測(cè)指標(biāo)和診斷手段,因此可能導(dǎo)致在發(fā)現(xiàn)卵巢癌時(shí),其臨床分期已較晚或已發(fā)生轉(zhuǎn)移,所以卵巢癌的治療效果欠佳,預(yù)后比較差。近年來隨著腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和化療水平的不斷提高,卵巢癌患者的死亡率也逐漸有所改善,但因?yàn)槁殉舶┗颊弑话l(fā)現(xiàn)多以致晚期而又可能得不到及時(shí)有效的治療,其晚期卵巢癌患者的5年生存率不足30%,目前其死亡率高居?jì)D科三大惡性腫瘤之榜首。卵巢癌發(fā)生及發(fā)展是一個(gè)多途徑、多階段、多機(jī)制的較為復(fù)雜的過程。雖然既往已有很多研究試圖來闡述卵巢癌致病因素,但卵巢癌生物學(xué)行為的分子機(jī)制仍不明確。越來越多的證據(jù)已表明:抑癌基因失活或原癌基因激活以及它們之間的相互作用失去平衡是卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)。因此,研究和探索卵巢癌的發(fā)病機(jī)制,進(jìn)一步明確卵巢癌分子生物細(xì)胞學(xué)的惡性行為,尋找更為有效的監(jiān)測(cè)卵巢癌分子生物學(xué)指標(biāo),研究與卵巢癌相關(guān)的重要基因及其介導(dǎo)的信號(hào)分子機(jī)制通路將是當(dāng)前卵巢癌臨床治療所面臨和亟待解決的嚴(yán)峻課題。異位病毒整合位點(diǎn)1(ectopic viral integration site-1,Evil)基因是一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄基因位點(diǎn),其編碼的蛋白是帶有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,定位于染色體3q26,他的基因長度是60000bp,其中外顯子16個(gè),是SET/PR轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員。Evil基因作為一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄因子,通過特定的GACMGATA序列與目標(biāo)基因的DNA相結(jié)合,從而發(fā)揮它對(duì)其下游基因表達(dá)的抑制或促進(jìn)功能。最早發(fā)現(xiàn)Evil基因是一種與惡性髓系腫瘤關(guān)的致癌性轉(zhuǎn)錄因子,在哺乳動(dòng)物生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。雖然過去大量研究已證實(shí)Evil基因與血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,隨著對(duì)Evil基因研究的深入,Evil基因在其他實(shí)體腫瘤領(lǐng)域內(nèi)的作用不斷被發(fā)現(xiàn)。新近研究表明,其在實(shí)體惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中亦起著重要作用,例如,在乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)Evil高表達(dá),并且和患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。目前,國內(nèi)外尚無Evil與卵巢癌生物學(xué)行為及化療敏感性的研究報(bào)道。Evil在卵巢癌中的表達(dá)情況如何,是否參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展,是否參與卵巢癌的化療耐藥等問題亟待解決。因此,本課題擬研究Evil在卵巢癌中的表達(dá)情況,研究調(diào)控其表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成能力及化療藥物敏感性的影響,初步探討Evil對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為和化療敏感性影響的分子機(jī)制,以期為卵巢癌患者基因治療提供新的生物學(xué)靶目標(biāo)。本研究分為以下三個(gè)部分:第一部分:Evil在卵巢癌中的表達(dá)及其意義;第二部分:抑制Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響及其分子機(jī)制的初步探討;第三部分:抑制Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞化療藥物敏感性的影響。第一部分:Evil在卵巢癌中的表達(dá)及其意義目的:通過檢測(cè)Evil在卵巢癌中的表達(dá)水平,結(jié)合患者臨床病例資料,分析其表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。方法:1.采用免疫組化和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)上皮性卵巢癌組織、良性腫瘤組織,正常卵巢組織中Evil蛋白的表達(dá)。2.采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)上皮性卵巢癌組織、良性腫瘤組織,正常卵巢組織中Evil mRNA的表達(dá)。3.采用Western blot檢測(cè)不同卵巢細(xì)胞內(nèi)Evil蛋白的表達(dá)。4.分析Evil表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。結(jié)果:1.在正常卵巢上皮組織內(nèi),Evil蛋白中無表達(dá),其主要表達(dá)于在良性卵巢腫瘤和上皮性卵巢癌組織的細(xì)胞核上,Evil基因免疫組化陽性表達(dá)的結(jié)果是呈棕黃色顆粒,免疫熒光陽性表達(dá)的結(jié)果是呈綠色熒光顆粒。Evil蛋白在正常卵巢上皮組織中的陽性表達(dá)率為0%(0/20),著色強(qiáng)度0級(jí);在良性卵巢組織中的陽性表達(dá)率為18%(4/22),著色強(qiáng)度1級(jí);在上皮性卵巢癌中的陽性表達(dá)率為55%(30/55),著色強(qiáng)度為3級(jí)。與正常卵巢上皮組織、良性卵巢腫瘤組織相比,Evil蛋白的陽性表達(dá)率在上皮性卵巢癌組織內(nèi)明顯較高,存在顯著區(qū)別P0.05。Evil蛋白在Ⅰ～Ⅳ期上皮性卵巢癌標(biāo)本組織中相對(duì)表達(dá)的陽性率分別21.41%,48.65%,65%和91.42%,各組之間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x 2=6.024,P0.05)。卵巢癌分期越晚,Evil蛋白表達(dá)的陽性率越高。2.在正常卵巢上皮組織中Evil mRNA無表達(dá),Evil主要存在于在良性卵巢腫瘤和上皮性卵巢癌組織內(nèi)的細(xì)胞核中,陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒。Evil mRNA在正常卵巢上皮組織中的陽性表達(dá)率為0%(0/20),著色強(qiáng)度0級(jí);在良性卵巢組織中的陽性表達(dá)率為14%(3/22),著色強(qiáng)度1級(jí);在上皮性卵巢癌中的陽性表達(dá)率為47%(26/55),著色強(qiáng)度為2級(jí)。相比正常卵巢上皮組織,良性卵巢腫瘤和上皮性卵巢癌組織Evil mRNA的陽性表達(dá)率與其著色程度明顯較高,且區(qū)別顯著,P0.05。3.Western blot結(jié)果顯示,與正常人卵巢細(xì)胞HOSEpiC相比,卵巢癌細(xì)胞OVACAR3,SKOV3,A2780,ES2,Caov3 和 COC1,Evil 蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為:0.32±0.01,0.53± 0.02,0.49 ±0.01,0.51 ±0.01,0.31 ±0.01 和 0.32±0.02,卵巢癌細(xì)胞的Evil蛋白表達(dá)量與正常卵巢細(xì)胞相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.卵巢上皮癌組織中Evil蛋白和mRNA的異常表達(dá)與患者年齡、病理類型之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但其表達(dá)與臨床分期、組織分化、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P0.05)。臨床分期越晚、組織分化越差和伴隨淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,卵巢癌組織Evil蛋白的異常表達(dá)就越明顯。小結(jié):1、與正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織相比,Evil蛋白和mRNA在上皮性卵巢癌組織中高表達(dá),其主要表達(dá)于在胞核上。2、與正常卵巢上皮細(xì)胞HOSEpiC相比,Evil蛋白在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)。3、上皮性卵巢癌患者中Evil蛋白的表達(dá)與臨床分期、組織分化及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),臨床分期越晚、組織分化越差和伴隨淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,卵巢癌組織Evil蛋白的異常表達(dá)就越明顯。第二部分:抑制Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響及其分子機(jī)制的初步探討目的:探討抑制Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成能力的影響,初步探討Evil參與卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。方法:1.應(yīng)用GV159慢病毒載體,在OVCAR3、SKOV3細(xì)胞中構(gòu)建干擾Evil表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株,熒光定量PCR方法驗(yàn)證穩(wěn)定細(xì)胞株是否構(gòu)建成功。2.運(yùn)用CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾Evil表達(dá)后對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響。3.運(yùn)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾Evil后表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力的影響;4.采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與增殖相關(guān)的調(diào)控因子cyclin Dl,CDK4的變化情況;5.運(yùn)用Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾Evil表達(dá)后對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移能力的影響;6.運(yùn)用Matrigel膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾Evil表達(dá)后對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的影響;7.運(yùn)用小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾Evil表達(dá)后對(duì)卵巢癌細(xì)胞新生血管形成能力的影響;8.采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與卵巢癌細(xì)胞的侵襲相關(guān)因子AKT、GSK3 β、Snail的變化9.運(yùn)用Annexin-V/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡能力的影響;采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞的相關(guān)凋亡蛋白的影響10.建立卵巢癌裸鼠移植瘤模型,檢測(cè)干擾Evil表達(dá)后對(duì)裸鼠移植瘤增殖的影響;運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)移植瘤組織中MVD密度情況,分析體內(nèi)調(diào)控Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。結(jié)果:1.為進(jìn)一步研究Evil對(duì)卵巢癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響,根據(jù)Evil在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平,我們用Evil呈現(xiàn)高表達(dá)的OVCAR3、SKOV3細(xì)胞構(gòu)建干擾Evil表達(dá)慢病毒的穩(wěn)定細(xì)胞株。表達(dá)載體以綠色熒光蛋白EGFP作為標(biāo)記,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法驗(yàn)證穩(wěn)定株是否構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,OVCAR3細(xì)胞中,與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的對(duì)照組細(xì)胞(OVCAR3-anti-NC)細(xì)胞相比較,轉(zhuǎn)染干擾Evil表達(dá)慢病毒質(zhì)粒載體的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(OVCAR3-anti-Evil)中Evil mRNA水平顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;SKOV3細(xì)胞中,與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的對(duì)照組細(xì)胞(SKOV3-anti-NC)細(xì)胞相比較,轉(zhuǎn)染干擾Evil表達(dá)慢病毒質(zhì)粒載體的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(SKOV3-anti-Evil)中Evil mRNA水平顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果顯示,干擾Evil表達(dá)卵巢癌穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功。2.我們采用CCK-8法檢測(cè)干擾Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響。在SKOV3、OVCAR3細(xì)胞干擾Evil表達(dá)并設(shè)置空白對(duì)照Blank組和陰性對(duì)照NC組,在轉(zhuǎn)染后1d,2d,3d,4d,5d和6d測(cè)定細(xì)胞生存活力。CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染anti-Evil的細(xì)胞在2天開始增殖活性顯著低于空白Blank組細(xì)胞和陰性NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞(p0.01),3d,4d,5d和6d其活性降低程度更為顯著(p0.001)。3.采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與OVCAR3-Blank組相比,OVCAR3-anti-NC組細(xì)胞的克隆形成能力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(141.37±2.449%vs 135.19±1.539%,P 0.05);與 OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC 組對(duì)照細(xì)胞相比較,干擾 Evil表達(dá)慢病毒后,OVCAR3-anti-Evil組細(xì)胞的克隆形成能力(32.41±1.579%)顯著抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。與SKOV3-Blank組相比,SKOV3-anti-NC組細(xì)胞的克隆形成能力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(126.45±1.454%vs 117.09±2.872%,P0.05);與SKOV3-Blank、SKOV3-anti-NC組對(duì)照細(xì)胞相比較,干擾Evil表達(dá)慢病毒后,SKOV3-anti-Evil組細(xì)胞的克隆形成能力(49.21±2.953%)顯著抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。4.采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與增殖相關(guān)的調(diào)控因子cyclin Dl,CDK4的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在OVCAR3和SKOV3細(xì)胞株中,敲除Evil表達(dá)之后,降低了磷酸化AKT即P-AKT的表達(dá),同時(shí)降低了 cyclinD1和CDK4蛋白的表達(dá)水平。5.采用Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移能力的影響;采用Matrigel膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的影響。Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,無血清培養(yǎng)24小時(shí)后OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC、OVCAR3-anti-Evil、SKOV3-Blank、SKOV3-anti-NC、SKOV3-anti-Evil組細(xì)胞由上室面穿出至下室面的細(xì)胞數(shù)分別為84.25±0.164、81.91±0.334、20.43±0.413、86.95±0.381、81.24±0.328、35.53±0.129。與 OVCAR3-anti-NC組細(xì)胞相比較,干擾Evil表達(dá)的OVCAR3-anti-Evil組細(xì)胞遷移能力顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)；與SKOV3-anti-NC組細(xì)胞相比較,干擾Evil表達(dá)的SKOV3-anti-Evil組細(xì)胞遷移能力顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0015)。6.Matrigel膠侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,無血清培養(yǎng)48小時(shí)后OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC、OVCAR3-anti-Evil、SKOV3-Blank、SKOV3-anti-NC、SKOV3-anti-Evil組細(xì)胞由上室面穿出至下室面的細(xì)胞數(shù)分別為76.23±0.436、73.36±0.131、23.41 ±0.428、89.04±0.549、84.49±0.249、19.22±0.252,與 OVCAR3-anti-NC組細(xì)胞相比較,干擾Evil表達(dá)的OVCAR3-anti-Evil組細(xì)胞侵襲能力顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)。與SKOV3-anti-NC組細(xì)胞相比較,SKOV3-anti-Evil組細(xì)胞的侵襲能力顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00018)。7.Evil通過AKT/GSK3β/Snail促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲。上述實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證,Evil可以提高p-AKT蛋白的水平,進(jìn)而促進(jìn)AKT的活化。此次Westernblot實(shí)驗(yàn)證實(shí):在OVCAR3和SKOV3細(xì)胞株中,敲除Evil表達(dá)之后,p-AKT蛋白的水平下降,p-AKT下游的的p-GSK3β表達(dá)也下降,而總的GSK3β則無明顯變化。同時(shí),Smail蛋白的表達(dá)水平也出現(xiàn)了下調(diào),與EMT相關(guān)的E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高,Vimentin蛋白表達(dá)下降。8.我們采用小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞新生血管形成能力的影響。收集 OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC、OVCAR3-anti-Evil、SKOV3-Blank、SKOV3-anti-NC、SKOV3-anti-Evil 組細(xì)胞的培養(yǎng)上清,消化 HUVEC 細(xì)胞后,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清重懸HUVEC細(xì)胞,培養(yǎng)24小時(shí)后觀察HUVEC細(xì)胞小管管腔形成情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,無論是在OVCAR3細(xì)胞還是SKOV3細(xì)胞里,Blank組與anti-NC組HUVEC細(xì)胞的小管管腔形成能力相比,兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與 OVCAR3-Blank(40.86±0.261)、OVCAR3-anti-NC(38.57±0.250)組相比較,干擾 Evil 表達(dá)的 OVCAR3-anti-Evil(20.73±0.230)組HUVEC細(xì)胞的小管管腔形成能力顯著抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與 SKOV3-Blank(32.02±0.251)、SKOV3-anti-NC(29.12±0.460)組相比較,干擾Evil表達(dá)的SKOV3-anti-Evil(13.27±0.158)組HUVEC細(xì)胞小管管腔形成能力受到抑制更為顯著,兩組間相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。9.AnnexinV/PI 染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC、OVCAR3-anti-Evil 組細(xì)胞的凋亡率分別為(6.18±0.022)%、(6.32±0.035)%和(15.59±0.048)%,OVCAR3-Blank 和 OVCAR3-anti-NC 組細(xì)胞相比較,細(xì)胞的凋亡率無明顯差異(P0.05)。干擾Evil表達(dá)OVCAR3-anti-Evil組細(xì)胞的凋亡率與其兩組對(duì)照組相比明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);SKOV3-Blank、SKOV3-anti-NC、SKOV3-anti-Evil 組細(xì)胞的凋亡率分別為(7.08±0.041)%、(7.30±0.055)%和(15.58±0.068)%,SKOV3-Blank 和 SKOV3-anti-NC 組細(xì)胞相比較細(xì)胞的凋亡率無明顯差異(P0.05)。干擾Evil表達(dá)SKOV3-anti-Evil組細(xì)胞的凋亡率與其兩組對(duì)照組相比明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí):在OVCAR3和SKOV3細(xì)胞株中,敲除Evil表達(dá)之后,Bc12蛋白表達(dá)下調(diào),cleaved-Caspas3蛋白表達(dá)上調(diào)。提示下調(diào)Evil表達(dá)促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明Evil抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的增殖能力。10.我們采用BALB/C-nu雌性裸鼠建立卵巢癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?進(jìn)行干擾Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌增殖、侵襲影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾Evil表達(dá)的OVCAR3-anti-Evil組裸鼠的腫瘤體積顯著小于OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC兩個(gè)對(duì)照組的裸鼠,隨飼養(yǎng)天數(shù)增加,裸鼠移植瘤體積差異逐漸增大,實(shí)驗(yàn)組分別與兩個(gè)對(duì)照組進(jìn)行組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。裸鼠移植瘤組織免疫組化檢測(cè)腫瘤微血管密度,結(jié)果顯示,裸鼠移植瘤組織中CD34內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記染色呈棕黃色,定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜,與OVCAR3-anti-NC組裸鼠相比較,干擾Evil表達(dá)OVCAR3-anti-Evil組裸鼠腫瘤組織中MVD平均值顯著降低,兩組間相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾Evil表達(dá)可減少腫瘤組織血管生成,促進(jìn)組織凋亡壞死發(fā)生,抑制腫瘤的增殖和侵襲。小結(jié):1.體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾Evil表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。2.Evil在卵巢癌細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)可能是通過對(duì)PI3K-AKT信號(hào)通路的活化來實(shí)現(xiàn)的。第三部分:抑制Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞化療藥物敏感性的影響目的:探討干擾Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌化療藥物敏感性有無影響及其對(duì)耐藥機(jī)制的初步探討。方法:1.應(yīng)用GV159慢病毒載體,在OVCAR3、SKOV3細(xì)胞中構(gòu)建干擾Evil表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株2.通過 CCK-8 法檢測(cè) OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC、OVCAR3-anti-Evil 三組細(xì)胞株及 SKOV3-Blank、SKOV3-ainti-NC、SKOV3-anti-Evil 三組細(xì)胞株生長抑制率并計(jì)算IC50。3.軟瓊脂培養(yǎng)克隆試驗(yàn)檢測(cè)干擾Evil表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞在DDP中的克隆抑制率。4.利用Western blot檢測(cè)Evil表達(dá)下調(diào)后不同細(xì)胞株多藥耐藥蛋白P-gp和MRP1的表達(dá)變化。5.利用Western blot檢測(cè)抑制Evil表達(dá)后不同細(xì)胞株DNA損傷修復(fù)酶MGMT、MMR的改變。結(jié)果:1.通過CCK-8法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞株生長抑制率并計(jì)算IC50,我們發(fā)現(xiàn)在OVCAR3和SKOV3細(xì)胞株單獨(dú)使用DDP的耐藥指數(shù)是28.73±0.75μg/ml和27.92±1.07μg/ml,同時(shí)OVCAR3和SKOV3空載體組與DDP聯(lián)合作用的耐藥指數(shù)分別是 27.49±0.52μg/ml 和 26.32±0.63μg/ml,然而 OVCAR3 和 SKOV3 細(xì)胞的干擾Evil表達(dá)組與DDP聯(lián)合作用的耐藥指數(shù)分別是13.67±1.08μg/ml和15.86±1.31μg/ml,這表明在卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3和SKOV3中抑制Evil表達(dá)之后,卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性明顯升高,耐藥性明顯降低(P0.05)。2.分別取生長狀態(tài)尚可的 OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC、OVCAR3-anti-Evil 三組細(xì)胞株及 SKOV3-Blank、SKOV3-anti-NC、SKOV3-anti-Evil 三組細(xì)胞株培養(yǎng)克隆。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示,與Blank對(duì)照組及NC空白組相比,Evil干擾組的SKOV3和OVCAR3細(xì)胞在DDP中的克隆抑制率明顯增高(P0.05),說明干擾Evil表達(dá)加上DDP可以明顯降低卵巢癌細(xì)胞的克隆能力,進(jìn)一步證實(shí)了 Evil表達(dá)下調(diào)的卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP藥物敏感性顯著增高。3.為進(jìn)一步探討Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞耐藥性影響的機(jī)制,我們利用Western blot檢測(cè)Evil表達(dá)下調(diào)后不同細(xì)胞株多藥耐藥蛋白P-gp和MRP1的表達(dá)變化。結(jié)果如圖所示,我們發(fā)現(xiàn)抑制Evil后,SKOV3和OVCAR3細(xì)胞株中P-gp和MRP1的表達(dá)明顯下降(P0.05),由此我們考慮Evil可能是通過調(diào)節(jié)多藥耐藥蛋白來影響卵巢癌順鉑耐藥性的。4.上一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Evil表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞DDP敏感性的影響并不是通過多藥耐藥蛋白來調(diào)控的,在這部分我們繼續(xù)用Western blot檢測(cè)抑制Evil表達(dá)后不同細(xì)胞株DNA損傷修復(fù)酶MGMT、MMR的改變,以探求可能調(diào)控的另外一種機(jī)制。結(jié)果如圖所示,我們發(fā)現(xiàn)Evil表達(dá)下調(diào)后,SKOV3和OVCAR3細(xì)胞株中MGMT、MMR的蛋白均顯著下降,我們推測(cè)Evil可能是通過影響DNA損傷修復(fù)酶的變化來調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞DDP耐藥性。小結(jié):1.干擾Evil表達(dá)可以提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。2.Evil可能是通過多藥耐藥蛋白及DNA損傷修復(fù)酶的作用機(jī)制來影響卵巢癌細(xì)胞化療藥物敏感性。結(jié)論:1.Evil異常表達(dá)與卵巢癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,可能參與了卵巢癌的惡性轉(zhuǎn)化;2.Evil可能通過對(duì)PI3K-AKT信號(hào)通路的活化進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移,抑制細(xì)胞的凋亡；3.Evil可能在多藥耐藥蛋白及DNA損傷修復(fù)酶共同作用下參與了卵巢癌細(xì)胞化療耐藥,干擾Evil表達(dá)可有效逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥;4.Evil基因有作為卵巢癌基因治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.31
【圖文】：

圖１．３邋Ｅｖｉｌ蛋白在不同卵巢組織的免疫組化結(jié)果的陽性率逡逑４．２邋Ｅｖｉｌ蛋白在不同期別的上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)逡逑Ｅｖｉｌ蛋白在丨？丨Ｖ期上皮性卵巢癌標(biāo)本組織中相對(duì)表達(dá)的陽性率分別是逡逑２１．４１％，４８．６５％，邋６５％和９１．４２％，各組之間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ｘ２＝６．０２４，逡逑ＩＩ逡逑

逡逑ＦＣ０．０５）。卵巢癌分期越晚，Ｅｖｉｌ蛋白表達(dá)的陽性率越高（圖１．４）。逡逑１００－１邐丁逡逑＂ｋｉｌｌ逡逑Ｉ期邋ＩＩ期邋ｍ朗邋ｉｖ期逡逑圖１．４邋Ｅｖｉｌ蛋白在上皮性卵巢癌組織（不同期別）的陽性率逡逑４．３在不同卵巢癌組織中Ｅｖｉｌ邋ｍＲＮＡ的表達(dá)逡逑在正常卵巢上皮組織中Ｅｖｉｌ邋ｍＲＮＡ無表達(dá)，Ｅｖｉｌ主要存在于在良性卵巢逡逑腫瘤和上皮性卵巢癌組織內(nèi)的細(xì)胞核中，陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒。Ｅｖｉｌ邋ｍＲＮＡ逡逑在正常卵巢上皮組織中的陽性表達(dá)率為０％邋（０／２０），著色強(qiáng)度０級(jí)；在良性卵逡逑巢組織中的陽性表達(dá)率為１４％邋（３／２２），著色強(qiáng)度１級(jí)；在上皮性卵巢癌中的陽逡逑性表達(dá)率為４７％邋（２６／５５），著色強(qiáng)度為２級(jí)。相比正常卵巢上皮組織和良性卵逡逑巢腫瘤，上皮性卵巢癌組織Ｅｖｉｌ邋ｍＲＮＡ的陽性表達(dá)率與其著色程度明顯較高，逡逑且區(qū)別顯著，Ｐ＜0．0５邋（圖１．５）。逡逑１２逡逑

＾邋＜／逡逑奪０邐，邐ｏｆ逡逑圖１．５邋Ｅｖｉｌ邋ｎｉＲＮＡ在各卵巢組織的原位雜交結(jié)果逡逑４．４邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)不同卵巢細(xì)胞內(nèi)Ｅｖｉｌ蛋白的表達(dá)結(jié)果逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ結(jié)果顯示，與正常卵巢細(xì)胞ＨＯＳＥｐｉＣ相比，卵巢癌細(xì)胞逡逑ＯＶＡＣＡＲ３，邋ＳＫＯＶ３，邋Ａ２７８０，邋ＥＳ２，邋Ｃａｏｖ３邋和邋ＣＯＣ１，邋Ｅｖｉｌ邋蛋白的相對(duì)表達(dá)量逡逑分別為：０．３２±０．０１，０．５３±０．０２，０．４９士０．０１，邋０．５１邋±０．０１，０．３１邋土０？０丨和邋０．３２逡逑±０．０２，卵巢癌細(xì)胞的Ｅｖｉｌ蛋白表達(dá)量與正常卵巢細(xì)胞相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異逡逑（圖邋１．６）。逡逑１３逡逑

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本文編號(hào)：2784544