【摘要】：子宮內膜異位癥是最常見的婦科疾病之一,主要臨床癥狀表現為痛經和不孕,目前臨床上對于子宮內膜異位癥缺乏理想的保守治療方案,而單純依賴于手術。這使得尋找確切的治療靶點,控制子宮內膜異位癥所導致的不孕成為了生殖內分泌疾病研究者一直追求的目標。組織學上,卵巢異位的子宮內膜腺體和基質被致密的纖維組織所包圍。一方面,這些過多的纖維組織會導致慢性疼痛并且影響輸卵管的拾卵功能。另一方面,卵巢的皮質區(qū)也可能被纖維組織包裹從而導致卵泡儲備減少。TGF-β是一種參與組織纖維化的關鍵因子,在子宮內膜異位癥患者的腹腔液和血液中均有TGF-β的高表達,并介導了子宮內膜異位癥的纖維化。NR4A1是類固醇/甲狀腺激素受體超家族中的一員,參與了細胞凋亡、糖脂代謝等各種生物學行為。已有研究表明,在硬皮病中NR4A1能夠負反饋調控TGF-β信號通路從而抑制其下游基因的表達。尚不清楚NR4A1是否在TGF-β介導的子宮內膜異位癥纖維化過程中起到調節(jié)作用。本研究旨在探索NR4A1是否參與了卵巢子宮內膜異位癥的發(fā)病過程,以及是否與卵巢子宮內膜異位癥中TGF-β介導的纖維化病變有關。通過驗證NR4A1在子宮內膜異位病灶中的表達變化,及探索其參與子宮內膜異位癥纖維化的相關作用機制,最終尋找有效的針對子宮內膜異位癥纖維化的潛在治療靶點。本研究主要分為以下三個部分:第一部分:NR4A1及P-NR4A1在人卵巢異位內膜組織及小鼠異位病灶形成過程中的表達實驗目的:檢測人卵巢異位子宮內膜組織與正常子宮內膜組織NR4A1及P-NR4A1的表達差異,以及裸鼠異位內膜不同時間點NR4A1及P-NR4A1的表達變化,揭示其與Qg異癥發(fā)病過程的關系。實驗方法:采用Western Blot和免疫組織化學染色的方法,分析23例人卵巢異位內膜和15例正常子宮內膜中NR4A1和P-NR4A1的表達差異。建立30只裸鼠子宮內膜異位癥模型,隨機分為6組,每組5只,并分別在建模第0、3、5、7、14、21天隨機處死一組小鼠,搜集小鼠異位病灶,行免疫組織化學染色法,分析裸鼠異位內膜病灶形成過程中NR4A1和P-NR4A1的表達變化。實驗結果:Western Blot和免疫組化的結果顯示23例人卵巢異位內膜和15例正常子宮內膜中NR4A1的含量并無顯著差異,但P-NR4A1在異位內膜中的含量明顯高于正常內膜。裸鼠異位病灶免疫組化染色結果顯示,在異位病灶的形成過程中,異位組織內P-NR4A1的表達隨時間增加。實驗結論:NR4A1參與了子宮內膜異位癥的發(fā)病過程,其在Qg異癥異位病灶形成的過程中發(fā)生了磷酸化。第二部分:NR4A1參與了子宮內膜異位癥中TGF-β介導的纖維化過程實驗目的:探索NR4A1在TGF-β介導的卵巢子宮內膜異位癥纖維化中的作用機制。實驗方法:分離培養(yǎng)原代卵巢異位內膜間質細胞和原代正常子宮內膜間質細胞,在TGF-β刺激后,提取細胞內總蛋白,行Western Blot和免疫熒光染色法觀察NR4A1和P-NR4A1在間質細胞中的表達變化。構建NR4A1的si RNA,并將轉染NR4A1si RNA的間質細胞暴露于TGF-β刺激下,提取細胞內RNA,采用實時定量熒光PCR(q RT-PCR)法分別檢測實驗組和對照組纖維化相關基因的表達。在NR4A1敲除的小鼠中構建子宮內膜異位癥模型,21天后處死小鼠并收集異位病灶,通過Sirius red和Masson染色觀察病灶的纖維化程度。將AKT的磷酸化抑制劑MK2206作用于間質細胞,并將細胞暴露于TGF-β的持續(xù)刺激下,通過Western Blot觀察NR4A1發(fā)生磷酸化的程度。實驗結果:在長期的TGF-β刺激下,間質細胞NR4A1的表達先增高后出現降低,但P-NR4A1的表達持續(xù)增高。在TGF-β刺激下,NR4A1低表達的細胞較對照組纖維化相關基因的表達增高。敲除NR4A1后,小鼠異位病灶的纖維化程度也明顯加重。MK2206能夠有效抑制TGF-β誘導下的NR4A1的磷酸化。實驗結論:NR4A1在TGF-β長期刺激下發(fā)生磷酸化失活,從而促進子宮內膜異位癥纖維化的發(fā)生,AKT通路參與了這一過程。第三部分:Csn-B能有效抑制子宮內膜異位癥的纖維化過程實驗目的:探索NR4A1能否作為子宮內膜異位癥纖維化的潛在藥物治療靶點。實驗方法:培養(yǎng)原代卵巢異位內膜間質細胞和原代正常子宮內膜間質細胞,在TGF-β刺激前,在細胞培養(yǎng)液中加入NR4A1的激動劑殼囊孢菌素B(Csn-B),24小時后提取細胞內RNA,采用實時定量熒光PCR(q RT-PCR)法分別檢測實驗組和對照組纖維化相關基因的表達。構建裸鼠子宮內膜異位癥模型,將20小鼠隨機分為兩組,一組注射Csn-B,另一組注射對照溶劑DMSO。21天后處死裸鼠并收集異位病灶,通過Sirius red和Masson染色觀察病灶的纖維化程度。實驗結果:Csn-B能有效降低TGF-β刺激下間質細胞內纖維化相關基因的表達。相比于對照組,Csn-B注射的裸鼠纖維化程度也明顯降低。實驗結論:Csn-B能夠有效降低子宮內膜異位癥的纖維化程度。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R711.71
【圖文】：

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文四、實驗結果1.NR4A1 在人異位子宮內膜中的表達沒有發(fā)生變化為了驗證 NR4A1 在異位子宮內膜和正常子宮內膜中的表達是否存在差異，我們收取了23例子宮內膜異位癥患者的異位內膜組織和15例原發(fā)性不孕患者的正常內膜組織，通過提取組織總蛋白，Western Blot 結果表明：NR4A1 在異位子宮內膜和正常子宮內膜中的表達并無顯著差異。免疫組織化學染色同樣提示：NR4A1 在異位子宮內膜中的表達較之正常對照組并沒有發(fā)生變化。

2.P-NR4A1 在人異位子宮內膜中的表達增高NR4A1 是孤兒核受體超家族的一員，其對生理病理機制的調節(jié)除了可以通過改變本身的表達量以外，還可以通過磷酸化等修飾作用來達到。為了驗證 NR4A1 在異位子宮內膜和正常子宮內膜中是否發(fā)生了磷酸化修飾，我們通過 Western Blot 檢測組織標本中 NR4A1 的磷酸化程度。結果表明：P-NR4A1 在人異位子宮內膜的表達較正常子宮內膜顯著增高。免疫組織化學染色同樣提示：P-NR4A1 在人異位子宮內膜中的表達比正常內膜更高。

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文3.NR4A1 在裸鼠異位內膜病灶形成過程中的表達變化對裸鼠建模后第 0、3、5、7、14、21 天的異位內膜病灶組織行免疫組織化學染色后，統計染色強度分析結果顯示： NR4A1 的表達量在裸鼠異位內膜病灶形成的第3 天開始增高，第 14 天開始下降，第 21 天的表達量仍然高于第 0 天的表達。

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本文編號：2781317