【摘要】：子宮內(nèi)膜異位癥是最常見的婦科疾病之一,主要臨床癥狀表現(xiàn)為痛經(jīng)和不孕,目前臨床上對(duì)于子宮內(nèi)膜異位癥缺乏理想的保守治療方案,而單純依賴于手術(shù)。這使得尋找確切的治療靶點(diǎn),控制子宮內(nèi)膜異位癥所導(dǎo)致的不孕成為了生殖內(nèi)分泌疾病研究者一直追求的目標(biāo)。組織學(xué)上,卵巢異位的子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)被致密的纖維組織所包圍。一方面,這些過多的纖維組織會(huì)導(dǎo)致慢性疼痛并且影響輸卵管的拾卵功能。另一方面,卵巢的皮質(zhì)區(qū)也可能被纖維組織包裹從而導(dǎo)致卵泡儲(chǔ)備減少。TGF-β是一種參與組織纖維化的關(guān)鍵因子,在子宮內(nèi)膜異位癥患者的腹腔液和血液中均有TGF-β的高表達(dá),并介導(dǎo)了子宮內(nèi)膜異位癥的纖維化。NR4A1是類固醇/甲狀腺激素受體超家族中的一員,參與了細(xì)胞凋亡、糖脂代謝等各種生物學(xué)行為。已有研究表明,在硬皮病中NR4A1能夠負(fù)反饋調(diào)控TGF-β信號(hào)通路從而抑制其下游基因的表達(dá)。尚不清楚NR4A1是否在TGF-β介導(dǎo)的子宮內(nèi)膜異位癥纖維化過程中起到調(diào)節(jié)作用。本研究旨在探索NR4A1是否參與了卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程,以及是否與卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中TGF-β介導(dǎo)的纖維化病變有關(guān)。通過驗(yàn)證NR4A1在子宮內(nèi)膜異位病灶中的表達(dá)變化,及探索其參與子宮內(nèi)膜異位癥纖維化的相關(guān)作用機(jī)制,最終尋找有效的針對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥纖維化的潛在治療靶點(diǎn)。本研究主要分為以下三個(gè)部分:第一部分:NR4A1及P-NR4A1在人卵巢異位內(nèi)膜組織及小鼠異位病灶形成過程中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?檢測(cè)人卵巢異位子宮內(nèi)膜組織與正常子宮內(nèi)膜組織NR4A1及P-NR4A1的表達(dá)差異,以及裸鼠異位內(nèi)膜不同時(shí)間點(diǎn)NR4A1及P-NR4A1的表達(dá)變化,揭示其與Qg異癥發(fā)病過程的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)方法:采用Western Blot和免疫組織化學(xué)染色的方法,分析23例人卵巢異位內(nèi)膜和15例正常子宮內(nèi)膜中NR4A1和P-NR4A1的表達(dá)差異。建立30只裸鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型,隨機(jī)分為6組,每組5只,并分別在建模第0、3、5、7、14、21天隨機(jī)處死一組小鼠,搜集小鼠異位病灶,行免疫組織化學(xué)染色法,分析裸鼠異位內(nèi)膜病灶形成過程中NR4A1和P-NR4A1的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Western Blot和免疫組化的結(jié)果顯示23例人卵巢異位內(nèi)膜和15例正常子宮內(nèi)膜中NR4A1的含量并無顯著差異,但P-NR4A1在異位內(nèi)膜中的含量明顯高于正常內(nèi)膜。裸鼠異位病灶免疫組化染色結(jié)果顯示,在異位病灶的形成過程中,異位組織內(nèi)P-NR4A1的表達(dá)隨時(shí)間增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:NR4A1參與了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程,其在Qg異癥異位病灶形成的過程中發(fā)生了磷酸化。第二部分:NR4A1參與了子宮內(nèi)膜異位癥中TGF-β介導(dǎo)的纖維化過程實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探索NR4A1在TGF-β介導(dǎo)的卵巢子宮內(nèi)膜異位癥纖維化中的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:分離培養(yǎng)原代卵巢異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和原代正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞,在TGF-β刺激后,提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白,行Western Blot和免疫熒光染色法觀察NR4A1和P-NR4A1在間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)變化。構(gòu)建NR4A1的si RNA,并將轉(zhuǎn)染NR4A1si RNA的間質(zhì)細(xì)胞暴露于TGF-β刺激下,提取細(xì)胞內(nèi)RNA,采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(q RT-PCR)法分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。在NR4A1敲除的小鼠中構(gòu)建子宮內(nèi)膜異位癥模型,21天后處死小鼠并收集異位病灶,通過Sirius red和Masson染色觀察病灶的纖維化程度。將AKT的磷酸化抑制劑MK2206作用于間質(zhì)細(xì)胞,并將細(xì)胞暴露于TGF-β的持續(xù)刺激下,通過Western Blot觀察NR4A1發(fā)生磷酸化的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在長期的TGF-β刺激下,間質(zhì)細(xì)胞NR4A1的表達(dá)先增高后出現(xiàn)降低,但P-NR4A1的表達(dá)持續(xù)增高。在TGF-β刺激下,NR4A1低表達(dá)的細(xì)胞較對(duì)照組纖維化相關(guān)基因的表達(dá)增高。敲除NR4A1后,小鼠異位病灶的纖維化程度也明顯加重。MK2206能夠有效抑制TGF-β誘導(dǎo)下的NR4A1的磷酸化。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:NR4A1在TGF-β長期刺激下發(fā)生磷酸化失活,從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥纖維化的發(fā)生,AKT通路參與了這一過程。第三部分:Csn-B能有效抑制子宮內(nèi)膜異位癥的纖維化過程實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探索NR4A1能否作為子宮內(nèi)膜異位癥纖維化的潛在藥物治療靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)方法:培養(yǎng)原代卵巢異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和原代正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞,在TGF-β刺激前,在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入NR4A1的激動(dòng)劑殼囊孢菌素B(Csn-B),24小時(shí)后提取細(xì)胞內(nèi)RNA,采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(q RT-PCR)法分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。構(gòu)建裸鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型,將20小鼠隨機(jī)分為兩組,一組注射Csn-B,另一組注射對(duì)照溶劑DMSO。21天后處死裸鼠并收集異位病灶,通過Sirius red和Masson染色觀察病灶的纖維化程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Csn-B能有效降低TGF-β刺激下間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。相比于對(duì)照組,Csn-B注射的裸鼠纖維化程度也明顯降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:Csn-B能夠有效降低子宮內(nèi)膜異位癥的纖維化程度。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R711.71
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.NR4A1 在人異位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)沒有發(fā)生變化為了驗(yàn)證 NR4A1 在異位子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)是否存在差異，我們收取了23例子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜組織和15例原發(fā)性不孕患者的正常內(nèi)膜組織，通過提取組織總蛋白，Western Blot 結(jié)果表明：NR4A1 在異位子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)并無顯著差異。免疫組織化學(xué)染色同樣提示：NR4A1 在異位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)較之正常對(duì)照組并沒有發(fā)生變化。

2.P-NR4A1 在人異位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)增高NR4A1 是孤兒核受體超家族的一員，其對(duì)生理病理機(jī)制的調(diào)節(jié)除了可以通過改變本身的表達(dá)量以外，還可以通過磷酸化等修飾作用來達(dá)到。為了驗(yàn)證 NR4A1 在異位子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜中是否發(fā)生了磷酸化修飾，我們通過 Western Blot 檢測(cè)組織標(biāo)本中 NR4A1 的磷酸化程度。結(jié)果表明：P-NR4A1 在人異位子宮內(nèi)膜的表達(dá)較正常子宮內(nèi)膜顯著增高。免疫組織化學(xué)染色同樣提示：P-NR4A1 在人異位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)比正常內(nèi)膜更高。

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文3.NR4A1 在裸鼠異位內(nèi)膜病灶形成過程中的表達(dá)變化對(duì)裸鼠建模后第 0、3、5、7、14、21 天的異位內(nèi)膜病灶組織行免疫組織化學(xué)染色后，統(tǒng)計(jì)染色強(qiáng)度分析結(jié)果顯示： NR4A1 的表達(dá)量在裸鼠異位內(nèi)膜病灶形成的第3 天開始增高，第 14 天開始下降，第 21 天的表達(dá)量仍然高于第 0 天的表達(dá)。

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1 陳s

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